Aeromonas spp.: evaluation of genomic diversity and biofilm forming ability

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Craveiro, Sara Sofia Pereira, 1986-
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/10823
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
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spelling Aeromonas spp.: evaluation of genomic diversity and biofilm forming abilityAeromonas spp.BiofilmesSegurança alimentarTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Aeromonas spp. are ubiquitous bacteria widely distributed among aquatic environments. Their persistence in water distribution systems is related to their ability to form biofilms, even in the presence of residual chlorine. Once in distribution water systems, aeromonads can contaminate drinking water, food processing facilities and food products. Moreover, members of this genus are known to be responsible for a variety of intra and extra-intestinal diseases in humans, their dissemination occurring essentially through the consumption of contaminated raw food or drinking water. Since the creation of this genus until the present days, Aeromonas taxonomy experienced several changes and numerous approaches have been applied attempting to resolve issues regarding aeromonads species allocation, but this important issue remains under debate. The present investigation had two main objectives: (i) determine the genomic diversity of aeromonads isolated from food, food processing surfaces, water and clinical samples using a multilocus sequence scheme, previously described and (ii) assess for the biofilm forming ability of a restricted number of isolates representing the microbial collection, and evaluating the effects of three commercial disinfectants on biofilm removal and prevention of biofilm formation. For multilocus sequence analysis PCR amplification of six housekeeping genes (gyrB, gltA, groL, metG, ppsA e recA) was performed for 118 Aeromonas spp., followed by nucleotide sequencing of the correspondent amplicons. Data analysis demonstrated the high genomic diversity of the isolates under study and further analysis, based on a dendrogram built with the concatenated sequences of five housekeeping genes, allowed aeromonads separation into five well-defined clusters, attributed to the species A. hydrophila, A. salmonicida, A. caviae and A. media. Regarding biofilm forming ability, the selected isolates were able to form biofilm on stainless steel coupons, at both refrigeration (4 oC) and room (20 oC) temperature. The disinfectants under study demonstrated to be efficient in removing biofilms at both temperatures, but were unsuccessful in preventing biofilm formation. Overall, the data obtained clearly demonstrated the high genomic diversity of the aeromonads under analysis and also showed promising results regarding species allocation. Furthermore, aeromonads ability to produce biofilm on stainless steel was proved, highlighting the importance of adequate cleaning and disinfection procedures, with emphasis on food processing settings.Os membros do género Aeromonas são ubíquos na natureza, podendo ser isolados de uma grande diversidade de ambientes aquáticos e estando associados a uma grande variedade de infecções intestinais e extra-intestinais em humanos e animais. Desde a sua criação até à atualidade, o género Aeromonas tem sido alvo de grande controvérsia, especialmente no que diz respeito à taxonomia. A análise concomitante de características fenotípicas e moleculares é, normalmente, incoerente. A utilização de inúmeras técnicas moleculares tais como hibridação DNA-DNA, sequenciação do rRNA 16S, Amplified Lenght Polymorphisms -RFLPs-, Random Amplified Polymorphic DNA -RAPD- e Pulsed Field Gel Electrophoresis -PFGE-, tem sido levada a cabo com o principal objetivo de ultrapassar esta barreira e, indubitavelmente definir a identificação dos membros deste género a nível de espécie, mas sem grande sucesso. A presença de aeromonas em ambientes aquáticos está intimamente relacionada com a sua resistência à cloração da água e à sua capacidade para produzir biofilmes. Uma vez sob a forma de biofilme, estes microorganimos tornam-se uma possível fonte de contaminação de águas para consumo e de alimentos, por contacto direto ou por contaminação dos locais de processamento dos mesmos; sendo que a disseminação para o Homem ocorre essencialmente por ingestão de água ou consumo de alimentos crus contaminados. Assim, o presente estudo teve dois objetivos principais: (i) avaliar a diversidade genómica de Aeromonas spp. isoladas de alimentos, ambientes de processamento alimentar, diferentes fontes de água e amostras clínicas, através de Multilocus Sequence Analysis e, adicionalmente, avaliar o potencial identificativo desta metodologia; (ii) avaliar a capacidade de formação de biofilme por membros representativos da coleção acima descrita e avaliar a eficácia de três desinfetantes comerciais na remoção de biofilme e na prevenção da formação do mesmo. De forma a cumprir o primeiro objetivo do trabalho, 118 estirpes de Aeromonas foram submetidas à amplificação de seis genes housekeeping, isto é, genes conservados no genoma de Aeromonas spp., que codificam para enzimas responsáveis por funções vitais na célula bacteriana. Esta técnica foi recentemente aplicada a membros do género Aeromonas por vários autores, embora a escolha dos genes a analisar não tenha sido consensual. No presente trabalho a escolha recaiu sobre o esquema delineado por Martino et al. (2011), que analisa os genes gyrB, gltA, groL, metG, ppsA e recA, uma vez que foi esta a metodologia que permitiu a criação da “Aeromonas MLST database”, disponível online através da plataforma NCBI- National Center for Biotechnology Information. Após amplificação dos genes selecionados por PCR, os respectivos amplicões foram enviados para sequenciação (Macrogen, The Netherlands) e os cromatogramas das sequências recebidas editados de forma a corrigir eventuais erros (SeqTrace, versão 0.81). De seguida, a sequência forward foi alinhada com a sequência reverse de forma a obter a sequência consensus. Posteriormente, uma vez que os primers foram desenhados de forma a obter um amplicão com tamanho superior ao fragmento genómico de interesse, foi necessário proceder à seleção desse fragmento. Para tal, foi realizado o alinhamento de todas as sequências obtidas com algumas das sequências constantes da base de dados Aeromonas MLST database de forma a selecionar o fragmento de interesse. De seguida as sequências obtidas foram comparadas com as já existentes na base de dados, de forma a determinar o perfil alélico e o Sequence Type-ST. Entre as aeromonas em estudo verificou-se que um elevado número possui novos perfis alélicos e apresenta STs ainda não descritos. Adicionalmente procedeu-se à elaboração da sequência concatenada utilizando 5 genes, com a exceção de ppsA devido a problemas na amplificação/sequenciação. Com base no concatâmero e utilizando o software BioNumerics 6.6 (Applied Maths, Bélgica) foi possível obter um dendrograma em que algumas das estirpes de referência de diferentes espécies -A. hydrophila, A. salmonicida, A. media e A. caviae- agrupam com isolados da colecção em estudo formando clusters bem definidos; o que sugere que as aeromonas agrupadas nesses clusters pertençam às espécies acima mencionadas. Para a concretização do segundo objetivo principal deste estudo, foram selecionados cinco isolados que haviam sido obtidos de origens distintas, nomeadamente locais de processamento de alimentos, água e amostras clínicas, como representantes da coleção anteriormente analisada. Adicionalmente foram introduzidas A. hydrophila subsp. hydrophila DSMZ 30187 e Aeromonas aeruginosa PAO1 como estirpes controlo dos ensaios referentes aos biofilmes. De forma a avaliar a capacidade de formação de biofilme em discos de aço inoxidável foram estudadas duas temperaturas de incubação, refrigeração (4 oC) e temperatura ambiente (20 oC), e períodos de crescimento de 48 h. A quantificação do biofilme formado foi realizada através do cálculo de unidades formadoras de colónias (UFC’s). Os resultados obtidos demonstraram que todas as estirpes em estudo possuem a capacidade de formar biofilme, tanto a 4 como a 20 oC, não tendo sido detectadas diferenças significativas na formação de biofilme entre estirpes ou temperaturas de incubação. Subsequentemente foi avaliada a eficácia de desinfectantes comerciais à base de (A) tensioativos anfotéricos, (B) compostos clorados e (C) peróxido de hidrogénio, na remoção de biofilme, bem como a prevenção da sua formação. Os desinfetantes demonstraram ser eficazes na remoção do biofilme, à exceção do desinfetante (A), que foi ineficaz na remoção do biofilme formado pelas aeromonas A31 e S2 (isoladas de um matadouro de suínos e de água de captação do Rio Tejo, respetivamente). Relativamente à inibição da formação de biofilme, avaliada perante a incubação das estirpes na presença dos respetivos desinfetantes, durante 48 h a 20 oC, nenhum dos desinfetantes demonstrou ser eficaz o que, em contexto real, reflete a possibilidade de concentrações residuais de desinfetante não inibirem a formação de biofilme em superfícies de processamento de alimentos de aço inoxidável, o que constitui um risco agravado para possíveis contaminações cruzadas. Em conclusão, os resultados obtidos demonstraram a elevada diversidade genómica da população em estudo, o que está de acordo com estudos realizados anteriormente por outros autores. Adicionalmente, sugere-se que a metodologia utilizada possa ser utilizada na identificação de Aeromonas a nível de espécie. No que diz respeito à formação de biofilme e ação de diferentes desinfetantes, os resultados obtidos evidenciam a capacidade de formação de biofilme em discos de aço inoxidável por aeromonas de diferentes origens e da importância deste facto em ambientes de processamento de alimentos, reinterando a importância de adequados procedimentos de limpeza e desinfeção desses locais.Lemsaddek, Teresa Maria Leitão SemedoReis, Ana Maria Gonçalves, 1958-Repositório da Universidade de LisboaCraveiro, Sara Sofia Pereira, 1986-2014-04-07T13:57:38Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/10823TID:201332191enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:56:38Zoai:repositorio.ul.pt:10451/10823Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:34:43.919879Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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