Identificação e sequenciação da acetilase mediada pelo plasmídeo recombinante pMdT1 em Escherichia coli

• Autor(a) principal: Magalhães, Pedro José Santana Ribeiro
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10348/6046
• topic: Escherichia coli; Resistência a antibióticos

A resistência a antibióticos é um problema gobal na medicina humana e veterinária. Escherichia coli é um microrganismo comensal do trato gastrointestinal de animais e humanos. Esta pode ser utilizada em diversos estudos biológicos e genéticos sobre a resistência aos antibióticos, um problema emergente de saúde pública. A presença do plasmídeo pMdT1 é de grande relevância no estudo da resistência aos antibióticos, visto que contém um gene que codifica uma variante da proteína AAC(6’)-lb-cr e que esta, quando ativa, confere resistência à tobramicina e à canamicina, e diminui a susceptibilidade à ciprofloxacina e à norfloxacina. Foram utilizadas duas amostras, Escherichia coli Electromax DH10B, recetora do processo de transformação e Escherichia coli TF-Se20 sendo esta transformada, pois contém o plasmídeo pMdT1 que expressa o gene da acetilase. Após a extração proteica, a separação e quantificação das proteínas foi realizada mediante a eletroforese monodimensional e posteriormente bidimensional, segundo os princípios de O’Farrel, contudo usando a tecnologia de IPG. As amostras foram sujeitas a uma focalização isoelétrica, seguida de SDS-PAGE. A identificação das proteínas foi realizada através da técnica MALDI-TOF/MS. Os picos de massa obtidos pelo motor de busca Mascot foram comparados com a base de dados Uniprot e NCBI. Para determinar a sequência da proteína de interesse, utilizou-se a técnica LC-MS/MS. Da amostra Escherichia coli TF-Se20 foram excisados 260 spots. Destes, foram identificados 111, e foi possível identificar 76 proteínas distintas, 71 das quais com função conhecida. Foram excisados 225 spots da amostra de Escherichia coli Electromax DH10B, tendo sido identificados 119, dos quais foi possível identificar 72 proteínas diferentes (71 têm processo biológico). As proteínas identificadas participam em diversos processos biológicos como no processo da glicólise, no processo de oxidação-redução e biossíntese de proteínas. A proteína de interesse, aminoglicosidase N(6')-acetiltransferase tipo 1, foi identificada e posteriormente sequenciada. Com um sinal correto, os resultados foram analisados através do Mascot e do Peaks, permitindo a identificação da proteína AAC com seis péptidos. Foi possível a identificação do péptido YSIVTNS(T) DSVTLR, que apresenta uma mutação de substituição, Asn (Aspargina) por uma Thr (Treonina). Para o péptido SHIVEWWGGEEARPTLAD VQE, apenas se obteve o match no Mascot. Como não se confirmou o match no Peaks, a classificação desta identificação foi “possível mas incerta”. Por sua vez, o péptido IA MLNGEPIGYA QSYVALGSGDGR foi confirmado, devido a ter sido validado várias vezes, quer na sua totalidade, quer de uma só parte. Os péptidos GLGTKLVR, MSNAKTKLGITK e QAFERTRSDA não foram detetados ou sequenciados corretamente. O péptido CYEKAGFE (G) QGTVTTPYG PAVYMVQTR foi validado pelo Mascot, apresentando uma mutação na qual uma Gly (Glicina) substitui uma Arg (Arginina). Concluiu-se desta forma que a proteómica pode ser usada para obter mais informação sobre os mecanismos de resistência e diferentes processos biológicos.