Effect of TGFβ signalling on CFTR protein: consequences for epithelial differentiation in CF
| Autor(a) principal: | |
|---|---|
| Data de Publicação: | 2015 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/22410 |
Resumo: | Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015 |
| id |
RCAP_0cc3c7cdb0aeaebad80220563e3ec69b |
|---|---|
| oai_identifier_str |
oai:repositorio.ul.pt:10451/22410 |
| network_acronym_str |
RCAP |
| network_name_str |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| repository_id_str |
7160 |
| spelling |
Effect of TGFβ signalling on CFTR protein: consequences for epithelial differentiation in CFCFTRC/EBPβFibrose quísticaTGFβTransição epitélio-mesenquimaTeses de mestrado - 2015Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A fibrose quística (FQ) é a doença letal autossómica recessiva mais comum na população caucasiana. A doença é causada por mutações na proteína CFTR (do inglês cystic fibrosis conductance regulator), a mais comum sendo uma deleção do resíduo de fenilalanina 508 (F508del). A CFTR encontra-se bem estabelecida como um canal iónico activado por AMP cíclico expresso na superfície apical de células epiteliais numa variedade de tecidos. A CFTR F508del no entanto adopta uma conformação anormal que potencia a sua retenção no reticulo endoplasmático e degradação. A maioria desta proteína não atinge a membrana plasmática. A CFTR tem um papel conhecido como transportador de cloro e bicarbonato. Além do transporte aniónico, esta proteína também tem um papel regulador em relação a outros canais na membrana, como a ENaC (do inglês epithelial sodium channel). Mutações na CFTR estão na origem das manifestações clínicas da doença. Os tecidos e orgãos mais afectados incluem as vias respiratórias, o tracto gastrointestinal e o sistema reprodutor. Insuficiência pancreática, mecónio e hepatopatia são sintomas recorrentes. A infertilidade masculina também é praticamente universal em pacientes. No entanto a maior causa de mortalidade resultante da FQ está associada com as vias respiratórias. Enquanto reguladora de conductância, a CFTR influencia o conteúdo em água e iões do ASL (do inglês, airway surface liquid) e a sua desregulação causa um volume reduzido do ASL e muco espesso e desidratado. Este muco obstrói as vias respiratórias mais pequenas e afecta a limpeza mucociliar, prejudicando a eliminação das bactérias e outros patogénicos inalados. Assim, o defeito na CFTR promove infecções persistentes por patogénicos resistentes a tratamento. Isto gera estimulação contínua por antigénios que resulta numa resposta inflamatória exacerbada e dano progressivo das vias respiratórias. Eventualmente isto conduz a fibrose e destruição do tecido. A fraca correlação entre o genótipo da CFTR e a doença pulmonar na FQ sugere o envolvimento de factores ambientais ou genéticos (genes modificadores da FQ) que afectam o desenvolvimento, progressão e severidade da doença. O TGFβ1 (do inglês transforming growth factor beta 1) tem sido dos mais estudados. O TGFβ controla a diferenciação, migração e morte celular programada. É também um poderoso regulador de respostas imunes, exercendo funções pro- e anti-inflamatórias e tem também um papel central na remodelação epitelial, equilibrando a síntese e degradação da matriz extracelular (MEC). A sinalização intracelular do TGFβ ocorre através de repectores específicos tipo II (TbR-II) que complexam com, e subsequente fosforilam, receptores tipo I (TbR-I). A via intracelular canónica para o TGFβ é mediada por uma família de factores de transcrição chamadas as proteínas Smad. Polimorfismos no TGFβ1 que aumentam a sua expressão foram encontrados em pacientes com FQ e correlacionados com baixa função pulmonar e doença pulmonar mais severa. Assim é especulado que o TGFβ1 funciona estabelecendo uma ponte entre a inflamação e a remodelação epitelial na FQ, modificando a progressão da doença. O TGFβ é também um importante indutor da transição epitélio-mesenquima (TEM). Uma TEM é um processo complexo em que células epiteliais completamente diferenciadas transitam para um fenótipo mesenquimal. A TEM é responsável pela morfogénese de tecidos e organogénese no embrião, bem como remodelação e reparação do tecido em adultos. No entanto é também um elemento importante na progressão do cancro e outras malignidades, como fibrose. A transição de células epiteliais para mesenquimais ocorre através de um programa conservado com certos passos. Primeiro ocorre a dissolução das junções celulares, seguido da perda da polaridade apical-basal. Isto é procedido pela reorganização da arquitectura do citosqueleto e alterações na forma celular, bem como desenvolvimento de protusões e motilidade e, em muitos casos, uma capacidade de degradar proteínas da MEC e promover comportamento invasivo. Finalmente, ocorre uma diminuição da expressão de genes/proteínas epiteliais e a activação de genes que ajudam a definir o fenótipo mesenquimal. Curiosamente, a CFTR já foi descrita como sendo não só dependente de mas também envolvida na diferenciação epitelial, possuindo um papel no desenvolvimento, fibrose e cancro. A diferenciação e regeneração das vias respiratórias foi encontrada como estando debilitada na FQ, mesmo na ausência de inflamação. No entanto, a inflamação exacerbada também possui um papel na expressão da CFTR. Num epitélio remodelado com inflamação severa, a expressão de CFTR foi identificada de forma difusa no citoplasma das células ou encontrava-se ausente. A descoberta das vias de sinalização do TGFβ, incluindo aquelas envolvidas na TEM, revelou mediadores da actividade transcripcional das Smads. Estes mediadores envolvem as proteínas C/EBP (do inglês CCAAT-enhancer binding proteins). Desta família de proteínas, o C/EBPβ é o factor de transcrição dominante no epitélio respiratório em adultos. O C/EBPβ tem funções ao nível da diferenciação de adipócitos, macrófagos e células epiteliais mamárias, controlo metabólico, inflamação e resposta de fase aguda e promoção da proliferação celular. O C/EBPβ possui dois tipos de isoformas distintos, incluindo dois activadores de transcrição (LAPs) e um inibidor de transcrição (LIP). O LIP reprime a expressão génica, inibindo as isoformas LAP de forma dominantemente negativa. A sinalização do TGFβ pode inibir as funções do C/EBPβ através das Smads. No entanto o C/EBPβ é também um co-factor do TGFβ: a indução do p15INK4b (do inglês cyclin-dependent kinase 4 inhibitor B) e repressão do c-Myc (ambos necessários para a resposta citóstatica do TGFβ) são dependentes do C/EBPβ. Curiosamente, um nível elevado de LIP (e nível diminuído de LAP) foi ligado a uma perda das respostas citostáticas dependentes do TGFβ em células metásticas de pacientes com cancro da mama. Consistentemente, um aumento do LIP em vários tipos de células epiteliais resultou num aumento de proliferação, diminuição na diferenciação e formação de hiperplasias. Além do TGFβ, o C/EBPβ é também regulado pelo miR-155. Este miRNA está envolvido em vários processos biológicos que incluem inflamação e imunidade. A estimulação com TGFβ aumenta os níveis de miR-155, que por sua vez aumenta o TEM dependente do TGFβ. A perda de C/EBPβ mediada pelo miR-155 foi descoberta como um mecanismo de promoção da progressão do cancro da mama por desviar a resposta do TGFβ de morte celular para TEM, invasão e metástase. Além disto, a expressão do miR-155 encontra-se aumentada em células pulmonares de FQ, comparando com os controlos. O objectivo principal deste trabalho era explorar a significância fisiológica da sinalização do TGFβ na ausência de CFTR functional, nomeadamente o seu papel na activação de TEM. Com este fim procurou-se: determinar se a TEM era um componente da FQ; avaliar o estado e localização do C/EBPβ na ausência de CFTR funcional; investigar o possível papel do C/EBPβ como mediador do TEM induzido por TGFβ; e avaliar o papel do miR-155 nos processos acima referidos. Tecido pulmonar (de controlos e pacientes de FQ) e células epiteliais brônquicas de FQ (do inglês, CFBE), expressando CFTR normal (CFTR wt) ou com a mutação F508del (CFTR F508del), foram usados para realizar estas tarefas. Análise do tecido de um paciente com FQ revelou remodelação consistente com inflamação crónica e ainda perda de diferenciação epitelial. A presença de marcadores mesenquimais e ausência/diminuição de marcadores epiteliais era consistente com a ocorrência de TEM. As diferenças no estado de diferenciação dos dois epitélios reflectiram as diferenças nos níveis de C/EBPβ. Este encontrava-se reduzido (ao nível de proteína e mRNA) nas células com CFTR F508del. Apesar de o C/EBPβ e a CFTR não interagirem ao nível proteico, redução de CFTR wt na membrana plasmática quando a expressão de C/EBPβ foi inibida sugere um envolvimento deste factor de transcrição no tráfego da CFTR para a membrana plasmática. Se este envolvimento é da isoforma LAP ou LIP ainda não é claro. O tratamento de células CFBE polarizadas com TGFβ reduziu a resistência transepitelial (do inglês, TEER) e a expressão da E-caderina, consistente com a indução de TEM. Apesar das funções anti-inflamatórias e anti-proliferativas do TGFβ, uma exposição de 48h a esta citocina parece desviar definitivamente a sua resposta para inflamação crónica e indução de TEM. Isto é consistente com o que foi encontrado no tecido do paciente com FQ. A TEER e a expressão de C/EBPβ encontravam-se mais reduzidas em células com F508del-CFTR após tratamento com TGFβ. Isto pode ser devidos aos níveis de LIP mais elevados encontrados para estas células mas pode também apontar para uma desregulação de outras vias, resultados do defeito na CFTR. Em apoio desta hipótese, observou-se que o miR-155 reprime a expressão de C/EBPβ em ambas as linhas celulares. No entanto nas células com CFTR F508del este impacto foi maior, o que sugere uma desregulação intrínseca dos níveis deste miRNA, podendo esta via estar desregulada sinergicamente com a do TGFβ. Surpreendemente os níveis de CFTR wt aumentaram com o tratamento com TGFβ e miR-155, enquanto os de CFTR F508del se mantiveram inalterados. Como isto é contraditório a um papel encontrado recentemente para o TGFβ em afectar a biogénese da CFTR, provavelmente o modelo utilizado não foi o melhor para avaliar estes níveis, já que a CFTR se encontra sobrexpressa. Este trabalho contribuiu para o melhor conhecimento do papel regulatório da CFTR na diferenciação epitelial e inflamação crónica na FQ.Cystic fibrosis (CF) is the most common life-threatening autosomal recessive disease in Caucasians. CF is caused by mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR). The most common one is the deletion of residue phenylalanine 508 (F508del). CFTR is well established as a cyclic AMP-activated anion channel, expressed in the apical surface of epithelial cells of a wide variety of tissues. F508del-CFTR, however, adopts an abnormal conformation which potentiates endoplasmic reticulum retention and degradation of the protein. Most of this protein fails to reach the plasma membrane. CFTR is known to conduct chloride and bicarbonate. In addition to anion transport, CFTR also has a regulatory role towards other epithelial channels, like the epithelial Na+ channel (ENaC). CFTR mutations are in the origin of the clinic manifestations of CF. The more severely damaged tissues and organs are the airways, gastrointestinal tract and reproductive system. Pancreatic insufficiency, meconium ileus and liver disease are recurrent symptoms. Male infertility is almost universal. However, most CF morbidity and mortality is associated with the respiratory tract. As a conductance regulator, CFTR influences the ion and water content of the airway surface liquid (ASL) and its dysregulation causes a reduced ASL volume as well as thick and dehydrated airway mucus. This mucus obstructs the small airways and impairs mucociliary clearance, prejudicing the removal of inhaled bacteria and other pathogens. Hence the CFTR defect promotes persistent infections by pathogens resistant to therapy. This generates continuous antigen stimulation which results in exacerbated inflammation and progressive airway damage. This eventually leads to airway fibrosis and destruction. The poor correlation between CFTR genotype and lung disease phenotype suggests the influence of environmental and secondary genetic factors (CF modifier genes) which affect the development, progression and disease severity. The transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) has been among the most studied. TGFβ controls differentiation, migration, and programed cell death. It is a master regulator of immune responses, exerting powerful pro- and anti-inflammatory functions and also has a central role in epithelial remodeling, balancing the extracellular matrix (ECM) production and degradation. Intracellular TGFβ signaling occurs via specific type II receptors (TbR-II) which complex with, and subsequently phosphorylate, type I receptors (TbR-I). The canonical intracellular signaling pathway for TGFβ1 is mediated by a family of transcription factors, the Smad proteins. TGFβ1 polymorphisms which increase its expression have been found on CF patients and reported to correlate with low lung function and a more severe pulmonary disease. TGFβ1 is therefore speculated to bridge the inflammatory and remodeling pathways in CF, modifying CF lung disease progression. TGFβ is also a major inducer of epithelial-mesenchymal transitions (EMTs). An EMT is a complex process whereby fully differentiated polarized epithelial cells transition into a mesenchymal phenotype. EMT underlies tissue morphogenesis and organogenesis in the embryo, as well as tissue remodelling and repair in adults. However, it is also an important element in cancer progression and malignancy, such as fibrosis. The transition of epithelial cells into mesenchymal cells occurs through a conserved programme with hallmarks. Firstly, there is the dissolution/disassembly of the epithelial cell–cell junctions, followed by loss of apical–basal polarity. This is followed by reorganization of the cytoskeletal architecture and changes in cell shape, as well as development of cell protrusions and motility and, in many cases, an ability to degrade ECM proteins to enable invasive behavior. Finally, there is a downregulation of the epithelial gene expression signature and activation of genes that help defining the mesenchymal phenotype. Interestingly, CFTR has been described to be not only dependent on but also involved in epithelial differentiation, having reported roles in development, fibrosis and cancer. Importantly, airway epithelial differentiation and regeneration has been reported to be impaired in bronchial epithelial CF cells, even in the absence of airway infection. However exacerbated inflammation can also affect CFTR expression. In a remodeled surface epithelium with severe inflammation, CFTR protein presented either a diffuse distribution in the cytoplasm of ciliated cells or was absent. Unveiling of TGFβ pathways, including those involved in EMT, has revealed mediators regulating the downstream Smad transcriptional activity. These include the CCAAT-enhancer binding proteins (C/EBP). Among this family, C/EBPβ has been reported to be the dominant DNA binding factor in the adult airway epithelium. C/EBPβ is known to have roles in the differentiation of adipocytes, macrophages and mammary epithelial cells; in metabolic control; in inflammation and acute-phase response; and in promoting cellular proliferation. C/EBPβ possesses distinct types of isoforms, including two transcriptional activators (LAPs) and one transcriptional inhibitor (LIP). LIP represses gene expression, inhibiting LAP isoforms in a dominant negative fashion. TGFβ signaling is known to induce Smad-dependent inhibition of C/EBPβ function. However, C/EBPβ can also serve as a cofactor for TGFβ signaling: induction of the cyclindependent kinase 4 inhibitor B (p15INK4b) and repression of c-Myc (both needed for the cytostatic response of TGFβ) were found to depend on C/EBPβ. Interestingly, a higher level of LIP (and decreased level of LAP) has successfully been linked to a loss of TGFβ-dependent cytostatic responses in metastatic cells from breast cancer patients. LIP increase in several epithelial cells resulted in an increase in proliferation, decrease in differentiation and formation of hyperplasias. In addition to TGFβ, C/EBPβ is also regulated by miR-155. This miRNA is reported to be involved in numerous biological processes including inflammation and immunity. TGFβ stimulation is also known to enhance miR-155 expression levels, augmenting the TGFβ-dependent EMT. Accordingly, miR-155-mediated loss of C/EBPβ was also found as a mechanism of promotion of breast cancer progression, by shifting the TGFβ response from growth inhibition to EMT, invasion and metastasis. Finally, expression of miR-155 was found to be elevated in CF lung epithelial cells, compared with control cells. The main goal of the present work was to explore the physiological significance of TGFβ signaling in the absence of functional CFTR, namely its possible role in activating EMT pathways. To achieve this it was sought to: determine if EMT was a component of CF disease; assessing the localization and status of transcription factor C/EBPβ in the absence of functional CFTR; investigating C/EBPβ’s possible role in mediating TGFβ induced EMT; and evaluating the role of miR-155 on these processes. Both lung tissue (from control and CF patients) and cystic fibrosis bronchial epithelial cells (expressing either wt or F508del-CFTR) were used to perform these tasks. Analysis of the CF tissue revealed tissue remodeling consistent with a chronic inflammation environment in the lung and a loss of epithelial differentiation. Furthermore, the presence of mesenchymal markers and loss of epithelial markers supported the notion of an EMT occurrence. The differences in the differentiation status seemed to reflect on the C/EBPβ levels. F508del-CFTR CFBE cells show reduced C/EBPβ protein and mRNA levels. Although CFTR and C/EBPβ were not found to interact on protein level, reduction of wt-CFTR at the plasma membrane when C/EBPβ was knocked down suggests an involvement of C/EBPβ in the traffic of CFTR to the plasma membrane. It is still unclear if this is mediated by the LAP or LIP isoform. TGFβ treatment of both polarized CFBE cell lines resulted in decreases in transepithelial electrical resistance (TEER) and loss of E-cadherin expression, consistent with a TGFβ-induced EMT. Despite the anti-inflammatory and anti-apoptotic roles known for TGFβ, a 48 hour exposure to this cytokine seemed to shift definitively the response towards chronic inflammation and EMT induction. This response is consistent with the findings on CF lung tissue. Accordingly, TEER and C/EBPβ expression were found to be more reduced in F508del- CFTR cells compared to wt after TGFβ treatment. This could be due to more increased LIP levels (which were observed on F508del-CFTR cells) but could also point to the involvement of other dysregulated pathways resulting from the CFTR defect. Accordingly, miR-155 was found to be repressing C/EBPβ on both cell types. However, on F508del-CFTR cells addition of miR- 155 had a larger impact on C/EBPβ levels. This could suggest that the CFTR dysfunction produces increased baseline levels of miR-155 which further contributes to decreasing C/EBPβ. This is in agreement with the TGFβ results, which point to additional dysregulated pathways resultant from CFTR defect affecting C/EBPβ levels. Surprisingly, the wt-CFTR levels increased with TGFβ and miR-155 treatment whereas F508del-CFTR showed no changes in expression. Since this is contradictory to recent findings that TGFβ impairs CFTR biogenesis, CFBE cells could not be the best model to assess CFTR levels in response to TGFβ treatment. This can be because these cell lines are overexpressing CFTR and, in this respect, do not perfectly recapitulate the in vivo situation. This work contributes to our understanding of the regulatory role of CFTR in epithelial differentiation and chronic inflammation in cystic fibrosis.Clarke, Luka A.Telhada, Maria Margarida Blasques,1951-Repositório da Universidade de LisboaQuaresma, Margarida Cuco2018-11-30T01:30:10Z201520152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/22410TID:201373831enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:09:33Zoai:repositorio.ul.pt:10451/22410Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:40:00.218510Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
| dc.title.none.fl_str_mv |
Effect of TGFβ signalling on CFTR protein: consequences for epithelial differentiation in CF |
| title |
Effect of TGFβ signalling on CFTR protein: consequences for epithelial differentiation in CF |
| spellingShingle |
Effect of TGFβ signalling on CFTR protein: consequences for epithelial differentiation in CF Quaresma, Margarida Cuco CFTR C/EBPβ Fibrose quística TGFβ Transição epitélio-mesenquima Teses de mestrado - 2015 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas |
| title_short |
Effect of TGFβ signalling on CFTR protein: consequences for epithelial differentiation in CF |
| title_full |
Effect of TGFβ signalling on CFTR protein: consequences for epithelial differentiation in CF |
| title_fullStr |
Effect of TGFβ signalling on CFTR protein: consequences for epithelial differentiation in CF |
| title_full_unstemmed |
Effect of TGFβ signalling on CFTR protein: consequences for epithelial differentiation in CF |
| title_sort |
Effect of TGFβ signalling on CFTR protein: consequences for epithelial differentiation in CF |
| author |
Quaresma, Margarida Cuco |
| author_facet |
Quaresma, Margarida Cuco |
| author_role |
author |
| dc.contributor.none.fl_str_mv |
Clarke, Luka A. Telhada, Maria Margarida Blasques,1951- Repositório da Universidade de Lisboa |
| dc.contributor.author.fl_str_mv |
Quaresma, Margarida Cuco |
| dc.subject.por.fl_str_mv |
CFTR C/EBPβ Fibrose quística TGFβ Transição epitélio-mesenquima Teses de mestrado - 2015 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas |
| topic |
CFTR C/EBPβ Fibrose quística TGFβ Transição epitélio-mesenquima Teses de mestrado - 2015 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas |
| description |
Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015 |
| publishDate |
2015 |
| dc.date.none.fl_str_mv |
2015 2015 2015-01-01T00:00:00Z 2018-11-30T01:30:10Z |
| dc.type.status.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| dc.type.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| format |
masterThesis |
| status_str |
publishedVersion |
| dc.identifier.uri.fl_str_mv |
http://hdl.handle.net/10451/22410 TID:201373831 |
| url |
http://hdl.handle.net/10451/22410 |
| identifier_str_mv |
TID:201373831 |
| dc.language.iso.fl_str_mv |
eng |
| language |
eng |
| dc.rights.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
| eu_rights_str_mv |
openAccess |
| dc.format.none.fl_str_mv |
application/pdf |
| dc.source.none.fl_str_mv |
reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação instacron:RCAAP |
| instname_str |
Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação |
| instacron_str |
RCAAP |
| institution |
RCAAP |
| reponame_str |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| collection |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| repository.name.fl_str_mv |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação |
| repository.mail.fl_str_mv |
|
| _version_ |
1799134307463200768 |