Anoctamins - novel members of ion channels family with extended functions and significance in disease

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pinto, Madalena do Carmo Fragoso
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/22437
Resumo: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
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spelling Anoctamins - novel members of ion channels family with extended functions and significance in diseaseFibrose QuísticaCFTRAnoctaminasTeses de mestrado - 2015Departamento de Química e BioquímicaTese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Cystic Fibrosis (CF) is the most common lethal autosomal recessive disorder in the Caucasian population, affecting 1 in 2500-6000 new-borns. CF is caused by mutations in the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene, which encodes a cAMP-regulated chloride (Cl-) and bicarbonate (HCO3-) channel expressed at the apical membrane of a variety of epithelial cells. The most common mutation in CF patients is F508del, a three base pair deletion that causes a single amino acid deletion from CFTR and disrupts its traffic and function, due to protein misfolding. Obstructive lung disease is the primary cause of morbidity in CF patients. Other symptoms of CF include elevated concentrations of sodium chloride (Cl-) in the sweat, pancreatic insufficiency, and male infertility, among others. Besides its function as a Cl- channel, CFTR also controls a number of other ion channels and transporters, being crucial to the ionic flow on epithelia. Among these other channels is the epithelial sodium (Na+) channel (ENaC) and members of the anoctamin family, some of which have been shown to function as Cl- channels. The latter constitutes a class of proteins that is only expressed in eukaryotic organisms. In mammals the family contains ten members (Ano1 to Ano10), with high sequence conservation, particularly around the putative channel pore forming region. Since the identification of Ano1 as a Ca2+-activated Cl- channel (CaCCs), in 2008, anoctamins have raised high interest as possible alternative Cl- channels to compensate for the loss of functional CFTR in CF. However, little is known about the regulation of their biogenesis, traffic or whether their channel function can be activated by other means, other than Ca2+ signalling. Such knowledge is, nevertheless, essential for their possible therapeutic use as alternative Cl- channels for CFTR. Anoctamins are involved in a variety of functions that besides ion transport, include phospholipid scrambling and regulation of other membrane proteins. Several lines of evidence suggest that anoctamins form homodimers, but the possibility of heterodimer formation has not been excluded. Also, some family members are reported to interact with each other. Despite some knowledge on this protein family, the structure and functions of all family members are not completely defined. The first two members of the family (Ano1 and Ano2) function as Ca2+-activated Cl− channels (CaCCs), while Ano6 was described as scramblase and also as a main component of the outwardly rectifying Cl- channels (ORCCs). Other members of the anoctamin family, such as Ano3, 4, 7, and 9, may work as phospholipid scramblases and/or ion channels, being their functions still poorly understood. Mutations in anoctamin genes (ANO3, ANO5, ANO6, and ANO10) cause various genetic disorders, suggesting the involvement of anoctamins in a variety of cellular functions. The core objective of this project was to identify novel regulators of Ano6 and also Ano9 and 10 and their interaction with other anoctamin family members and CFTR. To accomplish this goal three main tasks were proposed, namely, i) To generate novel cell lines stably expressing double-tagged Ano6, Ano9 and Ano10 constructs; ii) To use these constructs to develop robust cell-based traffic assays to be used in fluorescence high-throughput microscopy; iii) To use siRNA microscopy screens to identify novel genes involved in regulating the traffic of Ano6, Ano9 and Ano10 as potential drug targets for CF. The first task was completed for Ano6 and Ano9, while the second one was only accomplished for Ano6, and the third just started also for this protein. In summary, in this MSc project, double-tagged constructs of Ano6, 9 and 10 were created. The constructs of Ano6 and Ano9 were cloned into lentiviral vectors, and several cell lines expressing the double-tagged anoctamins under an inducible (Tet-On) promoter were generated. CFBE Ano6/Ano9 3-HA GFP cells were characterized by immunostaining (with polarized and non-polarized cells) and Western Blot techniques. Additionally, functional analysis of these proteins was assessed by both the iodide efflux technique and analysis in perfused micro-Ussing chamber on open circuit mode. Finally, a pilot screen of a small siRNA library targeting 231 genes (previously tested for CFTR traffic) was performed for CFBE Ano6 3-HA GFP cells. Overall the results showed that: The double-tagged construct of Ano6 is functional as a channel when overexpressed either in HEK 293T cells or in CFBE cells; The double-tagged construct of Ano9 seems to increase I- efflux in HEK 293T but shows no effect on ion currents on CFBE cells; Overexpressed Ano6 is located at the plasma membrane (and also at the cytoplasm); Overexpressed Ano9 is mostly intracellularly located but when at the cell membrane possibly forms dimers; CFBE cells stably expressing the inducible (Tet-On) Ano6 3-HA GFP construct constitute a robust cellular model for siRNA screens by automated high-content microscopy (HCM); Results from a pilot siRNA screen suggest that Ano6 traffic to the plasma membrane is affected by genes involved in several biological processes like G-protein coupled receptor signalling, ion transport, protein phosphorylation, and regulation of apoptosis, among others. Additional studies and further validation of these results could potentially constitute a new attractive approach for CF therapy involving alternative Cl- channels. Indeed, the regulation of anoctamins’ traffic is largely unknown and its better understanding will allow the exploration of this pathway to compensate for CFTR deficiency, making possible the development of new therapies for CF.A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população caucasiana, com uma prevalência de 1 em cada 2500-6000 nascimentos. Esta doença é causada por mutações no gene Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). Este gene, localizado no braço longo do cromossoma 7, codifica para uma glicoproteína com 1480 resíduos de aminoácidos localizada na membrana apical de uma grande variedade de células epiteliais, onde transporta cloreto (Cl-) e bicarbonato (HCO3-). Entre as mais de 2000 mutações conhecidas no gene CFTR, a mais comum consiste na deleção de três pares de bases, que resulta na remoção de uma fenilalanina na posição 508 (F508del) da proteína. Esta mutação está presente em aproximadamente 85% dos pacientes com FQ e afeta o processamento da proteína que, devido a um folding incorreto, fica retida intracelularmente ao nível do retículo endoplasmático (RE). Neste organelo é rapidamente enviada para degradação proteassomal, não chegando assim à membrana plasmática. Para além do seu papel como canal de aniões, a CFTR também funciona como reguladora de outros canais, tendo um efeito inibitório crítico na absorção de sódio (Na+) pela proteína ENaC (epithelial Na+ channel). Assim, os pacientes com FQ apresentam uma secreção de aniões diminuída, acompanhada por um aumento na absorção de Na+, o que leva à desidratação do líquido que reveste as vias respiratórias, airway surface liquid (ASL), e ao aumento da viscosidade e espessura do muco. Estas características causam uma eliminação ineficiente de agentes patogénicos pulmonares, resultando em infecções bacterianas recorrentes e, consequentemente, em inflamação crónica. Esta inflamação, dominada por neutrófilos, exacerba os processos de remodelação do tecido pulmonar e acaba por culminar na fibrose dos tecidos e perda da sua função. A doença pulmonar obstrutiva é a causa de morte mais comum em pacientes com FQ, sendo responsável por aproximadamente 80% da mortalidade. Para além deste fenótipo, outras manifestações da doença incluem a elevada concentração de NaCl no suor (sendo a base dos testes de diagnóstico mais comuns), insuficiência pancreática, infertilidade masculina, e ainda outras manifestações menos comuns como diabetes, ileus meconial, e obstrução intestinal e hepática. Como referido anteriormente, a CFTR tem um papel importante na regulação de outros canais e transportadores, sendo fundamental no transporte iónico no epitélio. Para além da ENaC já evidenciada, outros canais que possivelmente interatuam com a CFTR são os canais de cloreto ativados por cálcio (CaCC) e os canais de cloreto outwardly rectifying (ORCC), entre outros. Os CaCCs funcionam como transportadores iónicos transepiteliais em células secretoras e são caracterizados por apresentarem uma ativação dependente do aumento dos níveis de Ca2+ intracelular. Por sua vez, os ORCC demonstram uma relação I/V outwardly rectifying e são ativados por despolarização celular e via PKA e UTP extracelular. Vários estudos mostram que a CFTR inibe a produção endógena de corrente pelos CaCCs, estando esta aumentada nas vias respiratórias de pacientes com FQ. No entanto, a ativação dos ORCC pela PKA encontra-se diminuída no epitélio pulmonar de pacientes. As anoctaminas, proteínas que pertencem a uma família de 10 membros (Ano1 a Ano10) com elevada semelhança estrutural, foram associadas aos canais já referidos como regulados pela CFTR. A anoctamina 1 (Ano1) foi identificada como CaCC, sendo a sua função inibida com a activação da CFTR, enquanto a função de transporte por parte da CFTR é diminuída com a sobreexpressão da Ano1. Para além disso, a Ano6 foi identificada como componente principal dos ORCC. Assim, na presença de CFTR não mutada, é observada uma ativação paralela da CFTR e da Ano6, enquanto a Ano1 é inibida. Pelo contrário, em células com a CFTR mutada, a função da Ano6 é atenuada e a função da Ano1 aparenta estar aumentada. O interesse no estudo das anoctaminas aumentou fortemente desde a identificação da Ano1 como CaCC em 2008. Tal interesse deve-se maioritariamente ao facto destas poderem ser consideradas possíveis canais de Cl- alternativos para compensar a falta de CFTR funcional na FQ. Não obstante, o conhecimento sobre a sua biogénese, tráfego e ativação, é ainda muito reduzido. Tal conhecimento é, no entanto, essencial para o seu possível uso terapêutico como canais de Cl- alternativos para a CFTR. As anoctaminas estão envolvidas numa variedade de funções que, para além da função como transportadoras de iões já referida, ainda incluem scrambling de fosfolípidos e regulação de outras proteínas membranares. Vários estudos sugerem que as anoctaminas formam homodímeros, sendo ainda possível a formação de heterodímeros. Estes estudos são corroborados pela descoberta de interação entre alguns membros da família. Entre estes encontram-se a Ano1 e a Ano9, uma vez que estudos mostram que a sobreexpressão da Ano9 origina uma forte inibição das correntes produzidas pela Ano1. Apesar das características já conhecidas das anoctaminas, a estrutura e as funções de todos os membros da família ainda não estão completamente definidas. Enquanto os dois primeiros membros da família (Ano1 e Ano2) funcionam como CaCCs, a Ano6 foi descrita como principal componente dos ORCC e como scramblase. Outros membros da família, tais como Ano3, 4, 7 e 9, podem ter funções de scramblases e/ou canais de iões, estando ainda as suas funções concretas por desvendar. Mutações nos genes das anoctaminas (nomeadamente ANO3, ANO5, ANO6 e ANO10) causam diferentes doenças genéticas, sugerindo o envolvimento destas proteínas numa variedade de funções celulares. O objetivo do presente projeto foi a identificação de novos reguladores da Ano6, e ainda possivelmente da Ano9 e 10, e a interação das mesmas com outros membros da família de proteínas e com a CFTR. Para atingir este objetivo foram propostas três tarefas principais, nomeadamente, i) Criar linhas celulares que sobreexpressam de forma estável os construtos da Ano6, Ano9 e Ano10 com dois tags, ii) Usar estes construtos para desenvolver ensaios de tráfego robustos para serem utilizados em microscopia de fluorescência high-throughput, iii) Usar screens com bibliotecas de siRNAs para identificar novos genes envolvidos na regulação do tráfego da Ano6, Ano9 e Ano10, que possam ainda vir a ser utilizados como potenciais fármacos para a FQ. O primeiro passo foi concluído, tendo o segundo sido apenas realizado para a Ano6 e o último começado para a mesma. Resumindo, neste projecto de mestrado foram criados construtos da Ano6, Ano9 e Ano10 com dois tags. Os construtos da Ano6 e Ano9 foram clonados em vetores lentivirais, e foram criadas várias linhas celulares que expressam estas anoctaminas sob o efeito de um promotor indutível Tet-On. As células CFBE Ano6/Ano9 3-HA GFP foram caraterizadas por imunofluorescência (tanto em células polarizadas como não polarizadas) e por Western Blot. Adicionalmente a função destas proteínas foi testada em ensaios funcionais (efluxo de iodeto e micro-Ussing chamber). Por fim, para as células CFBE Ano6 3-HA GFP, foi feito um screen preliminar de uma pequena biblioteca de siRNAs que afetam 231 genes (previamente testados para o tráfego da CFTR). Os resultados obtidos ao longo deste trabalho sugerem que: O construto com dois tags da Ano6 é funcional como canal quando sobreexpresso tanto em células HEK 293T como em CFBE; O construto com dois tags da Ano9 parece aumentar o efluxo de iodeto em células HEK 293T mas não apresenta nenhum efeito no transporte de iões quando sobreexpresso em células CFBE; A Ano6 sobreexpressa está localizada na membrana plasmática (e também no citoplasma); A Ano9 sobreexpressa está principalmente localizada no citoplasma, mas quando se localiza na membrana plasmática forma possivelmente dímeros; As células CFBE que expressam de forma estável o contruto Ano6 3-HA GFP constituem um modelo celular robusto para realizar screens com siRNAs por Microscopia Automatizada (Análise de Alto Conteúdo); Os resultados de um screen de siRNA preliminar sugerem que o tráfego da Ano6 para a membrana plasmática é afetado por genes envolvidos em vários processos biológicos, tais como na sinalização de recetores acoplados a proteínas G, transporte de iões, fosforilação de proteínas e regulação da apoptose, entre outros. Estudos adicionais e posterior validação destes resultados podem potencialmente resultar numa nova estratégia apelativa para desenvolver terapias para a FQ envolvendo canais de Cl- alternativos. A regulação do tráfego das anoctaminas é ainda desconhecida e o seu estudo aprofundado irá permitir a exploração destas vias para compensar o defeito da CFTR, tornando possível o desenvolvimento de novas terapias para a FQ.Amaral, Margarida, 1958-Repositório da Universidade de LisboaPinto, Madalena do Carmo Fragoso2017-11-28T01:30:09Z201520152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/22437TID:201067714enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:09:37Zoai:repositorio.ul.pt:10451/22437Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:40:02.058325Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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