narcissus is required for the correct establishment of left-right asymmetries in the zebrafish brain

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Henriques, Pedro Miguel Dias, 1989-
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/9523
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
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spelling narcissus is required for the correct establishment of left-right asymmetries in the zebrafish brainBiologia do desenvolvimentoCérebroFisiologia animalPeixe-zebraTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013The vertebrate brain is functionally and anatomically left-right (L-R) asymmetric, yet how these asymmetries arise and are maintained during development is still poorly understood. ln zebrafish, the epithalamus comprises some of the most conspicuous asymmetries found in vertebrates, making it a valuable model to study their development. In it left and right dorsal habenulae (dHb) develop differently in size, cytoarquitecture and axonal connectivity. Additionally, the parapineal organ migrates to the left side and exclusively projects to the left habenula (lRb), being required for the development of its molecular and subsequent cytoarchitectural left-sided identity. Several studies have shown that Nodal Wnt and Notch signalling pathways have an important role in dHb asymmetric specification. However, how they interact with each other to achieve this is still largely unknown. Through a forward genetic screen our lab has identified the narcissus mutation which induces defects in the asymmetric specification of dRb neurons. Here, we show that in narcissus mutants, both habenulae display symmetric expression of some, but not all, 1Hb markers, and that the asymmetric afferent projections to the interpeduncular nucleus (IPN) and efferent innervation from the olfactory bulb and parapineal are disrupted. Additionally, both habenulae display significantly less BrdU incorporation in two tested timepoints, but asymmetric early neurogenesis still occurs. Together, our findings demonstrate that narcissus is required for the correct specification of L-R asymmetries in the zebrafish brain and provide a valuable background for future studies to decipher its role in the establishment and maintenance of these asymmetries during embryonic development.O cérebro é essencialmente assimétrico em termos anatómicos e funcionais, estando descritas assimetrias entre a esquerda e a direita no sistema nervoso de espécies representativas de praticamente todas as classes de vertebrados. De facto, há muito se sabe que várias funcionalidades se encontram extremamente lateralizadas no cérebro humano, como é o exemplo do processamento da linguagem, dominante no hemisfério esquerdo, e certas capacidades visuoespaciais no hemisfério direito. Mais recentemente, vários estudos mostraram haver uma relação positiva entre cérebros pouco lateralizados e deficiências congénitas de linguagem, como no caso da dislexia, levando à hipótese de que estas poderão estar ligadas a problemas no estabelecimento de assimetrias durante o processo ontogénico. Apesar disto, pouco se sabe atualmente sobre como as assimetrias de esquerda-direita (E-D) aparecem e como são mantidas durante o desenvolvimento embrionário do sistema nervoso. Há vários anos que o peixe-zebra tem provado ser um modelo valioso na área da biologia do desenvolvimento de vertebrados, muito devido ao seu bem caracterizado sistema genético, à facilidade de manipulação genética e celular e às suas propriedades óticas que facilitam técnicas de microscopia in vivo. No estudo do estabelecimento de assimetrias E-D, o peixe-zebra apresenta-se como particularmente útil. Neste organismo, a região cerebral do epitálamo, composta pelas habénulas e pelo complexo pineal, apresenta várias assimetrias entre a esquerda e a direita a nível citoarquitectónico, de expressão de genes e connectividade neuronal. A habénula dorsal do lado esquerdo é ligeiramente maior que a do lado direito, possuindo também uma maior concentração de neuropilo e expressão diferencial de genes. Esta diferença de expressão é na verdade tão acentuada, que permite a divisão dos núcleos da habénula nos subnúcleos lateral, demarcado pela expressão de kctd12.1, e medial, que expressa kctd12.2, e cujo tamanho é também proporcionalmente maior na esquerda e direita, respetivamente. Adicionalmente, o órgão parapineal, que origina de um subconjunto de células anteriores da glândula pineal, migra para o lado esquerdo e estabelece projeções axonais exclusivamente com a habénula esquerda, sendo inclusivamente necessário para a correta especificação dos neurónios do sub-núcleo lateral nesse lado. Cada habénula projeta também diferencialmente para o núcleo interpeduncular, situado no mesencéfalo, onde a região dorsal e ventral é inervada preferencialmente pelas habénulas esquerda e direita, respetivamente. Como se estabelecem estas assimetrias é ainda um tópico de grande debate. Sabe-se que a sinalização de Nodal, um dos primeiros eventos a quebrar a assimetria no embrião e necessária para o correto estabelecimento das assimetrias viscerais, possui também um papel crucial no estabelecimento das assimetrias epitamâmicas. Nodal é normalmente expresso no lado esquerdo do diencéfalo durante as primeiras fases do desenvolvimento, atuando como um bias no estabelecimento da lateralidade das assimetrias. De facto, vários estudos apontam para uma troca de informação entre a assimetria visceral e epitalâmica, sendo a primeira necessária para o estabelecimento da última através de uma interação mediada pela via de sinalização Wnt. Vários estudos apontam na verdade para o requerimento de algumas das maiores vias de sinalização para o correto estabelecimento e manutenção de assimetrias no epitálamo. Para além de necessária para a quebra de assimetria inicial, a sinalização Wnt tem também um papel crucial na correta especificação dos sub-núcleos habenulares, pois a sua inibição através de tratamentos farmacológicos ou por mutações genéticas induz a diferenciação de um maior rácio de neurónios do sub-tipo dorsal lateral em ambas as habénulas, assumindo estas uma especificação característica de esquerda. Adicionalmente, a via de sinalização Notch parece estar envolvida na manutenção da cronologia do programa de neurogénese diferente entre esquerda e direita, mostrando-se essencial para a especificação diferencial dos neurónios dos dois lados. De facto, a maior parte dos neurónios do sub-núcleo lateral nasce por volta das 32 horas-pós-fertilização (hpf) enquanto que neurónios do sub-núcleo medial nascem mais tarde às 48 hpf. Apesar de várias hipóteses serem apontadas para esta assimetria, a mais plausível assenta na ideia de que na direita, uma ativação assimétrica da sinalização Notch leva a uma mais longa manutenção da população de células estaminais, inibindo assim a neurogénese nesse lado. Apesar deste conhecimento, pouco se sabe em relação a como interagem estas vias de sinalização para o estabelecimento de assimetrias no epitálamo. Para melhor compreender isto, o nosso laboratório realizou um screening genético para identificar mutações que resultem em problemas de assimetria epitalâmica. Um destes mutantes, narcissus (nss), é caracterizado pela bilateralidade de marcadores característicos da habénula esquerda, como kctd12.1, e sub-expressão de marcadores da habénula direita, como kctd8. Neste estudo, procurei caracterizar em maior detalhe o mutante narcissus e tentei identificar os mecanismos através dos quais este gera as perturbações de assimetria observadas. Nos mutantes narcissus, todas as projeções aferentes e eferentes assimétricas para e das habénulas estão afetadas. Apesar da parapineal migrar corretamente para a esquerda, as suas projeções para a habénula esquerda possuem uma distribuição mais extensa do que em embriões controlo, cujas projeções tendem a acumularem-se em regiões mais próximas da habénula. Adicionalmente, a projeção assimétrica para a habénula direita, proveniente de células mitrais no bolbo olfactório e marcadas pela expressão do transgénico Tg(lhx2a:gap-YFP) estão completamente ausentes nos mutantes narcissus. Este defeito não será no entanto a provável causa da expressão simétrica de kctd12.1, pois a ablação seletiva destas projeções em embriões controlo antes da formação da enervação no epitálamo não revelou qualquer alteração de expressão de kctd12.1 e do marcador da habenula direita kctd8. Inesperadamente, ambas as habénulas projetam também preferencialmente para a região ventral do núcleo interpeduncular, um fenótipo provavelmente causado por uma deficiência da sinalização de orientação axonial mediada por Nrpla/Sema3D, intimamente responsável por esta conexão. Ao contrário de outros mutantes onde marcadores da habénula esquerda são bilateralmente expressos, nos mutantes de narcissus, a expressão de Pku558b, que marca maioritariamente uma sub-população de neurónios na habénula do sub-tipo dorsal lateral, continua assimétrica aos 4 dias pós-fertilização (dpf). Por outro lado, a expressão de kctd12.1 começa por ser assimétrica até 2 dpf, apenas adquirindo bilateralidade aos 3 dpf. Através da análise da data do nascimento dos neurónios dos diferentes sub-núdeos habenulares, identificámos que nos mutantes narcissus ocorre significativamente menos proliferação nas habénulas às 32 e às 50 hpf, dois estádios do desenvolvimento em que a maioria dos neurónios dos dois sub-núcleos nascem. Este resultado sugere um mecanismo em mutantes onde uma diminuição da população de progenitores habenulares pode ser responsável pelos fenótipos observados. Apesar disto, a neurogénese assimétrica inicial mantém-se intacta nos mutantes narcissus. Em conclusão, neste trabalho demonstrámos que narcissus é crucial para o desenvolvimento das assimetrias no epitálamo do peixe-zebra, providenciando um valioso conhecimento para o decifrar do seu papel no estabelecimento e manutenção destas assimetrias em estudos futuros.Wilson, StephenThorsteinsdóttir, Sólveig, 1962-Repositório da Universidade de LisboaHenriques, Pedro Miguel Dias, 1989-2013-11-12T16:31:58Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/9523TID:201281864enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:54:01Zoai:repositorio.ul.pt:10451/9523Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:33:43.114700Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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