Dissecting neuronal miRNA-124 modulation: effects on secretome-mediated microglia deregulation in mSOD1-associated amyotrophic lateral sclerosis

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Colaço, Ana Rita Ambrósio
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/51879
Resumo: Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2020
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spelling Dissecting neuronal miRNA-124 modulation: effects on secretome-mediated microglia deregulation in mSOD1-associated amyotrophic lateral sclerosismiR-124 modulationAmyotrophic lateral sclerosisMotor-neuron secretomemSOD1 mice and cellular modelsSpinal cord microgliaNeurociênciasDomínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2020Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease affecting motor neurons (MN) with currently limited targets and biomarkers. Neuroinflammation is a key player for disease onset/progression and the relationship between MN dysfunction and microglial activation represents a major hallmark. Our recent data demonstrated overactivation of the N9-microglia exposed to exosomes from NSC-34-MNs carrying the SOD1G93A mutation (SOD1G93A-MNs). These mutated MNs and their exosomes were enriched in microRNA(miR)-124. After internalizing these exosomes, N9-microglia exhibited time-dependent polarization and upregulated miR-124. Likewise, soluble factors released by SOD1G93A-MNs produced harmful effects on N9-microglia (upregulation of pro-inflammatory mediators/alarmins and reduced phagocytosis). Considering the paracrine effects that upregulated neuronal miR-124 may have on microglia functional properties through the influence of MN-derived secretome, we anticipate that miR-124 can be an active player for microglia immune-deregulation. We aimed to investigate whether the immune balance/function of spinal microglia is modified by wild-type (WT) or SOD1G93A-MN secretome and if it relates with MN miR- 124 upregulation. As miRNAs have been progressively associated to deregulated pathways in ALS, we explored how the modulation of miR-124 in WT/diseased MNs modifies the secretome signature of inflammatory-associated miRNA content. Next, we aimed to clarify differences in microglia feedback to the secretome from WT/mutated MNs to better understand their immunoregulatory action. Since our preliminary data showed the anti-inflammatory benefits of miR-124 modulation in SOD1G93A-MNs in the murine N9-microglia cell line, our ultimate goal was to validate such data in the mice spinal cord (SC) microglia cultures, which better resemble in vivo conditions. We used mixed glial cultures isolated from the SC of 8-day-old WT and SOD1G93A mice, that were maintained for 21 days in vitro (DIV). Microglia were then isolated and used after 2 DIV. Additionally, WT and SOD1G93A-MNs were plated and differentiated for 1 day, when SOD1G93A-MNs were transfected with anti-miR-124 for 12 h and maintained for additional 48 h. Secretomes from WT/SOD1G93A/SOD1G93A anti- miR-124 MNs were collected at 4 DIV, incubated in microglia for 4/24 h and inflammatory/functional mediators were evaluated. We demonstrated that SOD1G93A-MNs have a specific miRNA profile (increased miR-124/miR-125b, decreased miR-146a/miR-21), which was fully recapitulated in mutated MNs secretome, except for miR-125b, probably due to its intracellular retention. These effects were reversed in SOD1G93A anti-miR-124-MNs and reflected in their secretome, validating miR-124 as a driver of such deregulation. Relatively to the influence exerted by the neuronal secretome, both spinal microglia responded similarly to WT MNs secretome, displaying decreased inflammatory-associated markers upon 24 h incubation, suggesting the immunosuppressive action of this secretome. Moreover, we proved that SOD1G93A-MNs secretome has an acute and immunostimulant impact on WT microglia by increasing pro-inflammatory-associated genes and also reducing the expression of markers involved in phagocytosis and intercellular communication. In contrast, these inflammatory-associated markers were decreased in SOD1G93A microglia exposed to SOD1G93A-MN secretome, indicating their inability to mount a reparative response. As we anticipated that miR-124 elevation in SOD1G93A-MNs is partially associated with a secretome exerting microglial phenotypic aberrancies, our next results were directed to assess the microglia regenerative effects after incubation with SOD1G93A-anti-miR-124 MN secretome. Such modulation was able to prevent the upregulation of iNOS/IL-1β/IL-18/HMGB1, observed in WT microglia incubated with mutated MNs-secretome. Overall, this work highlights the impact that MNs and their secretome have in ALS microglia immune balance and dysfunction. Our findings also point out, for the first time, the benefits of downregulating miR-124 in SOD1G93A-MNs as a strategy to prevent paracrine microglia activation and ALS-associated neuroinflammation, using the SOD1G93A mice. Future studies will be performed to validate these data in MNs and microglia generated from ALS patients with familiar and sporadic forms of the disease.A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma condição neurodegenerativa e fatal para a qual os alvos e biomarcadores são ainda limitados. Para além dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à origem desta doença, maioritariamente tendo como alvo principal o neurónio motor (NM) e sua degeneração, a neuroinflamação sobressai como um contributo-chave quer no início quer na progressão da doença. Para além disso, a relação entre a disfunção dos NMs e ativação microglial representa uma característica importante da ELA, sendo por isso uma doença caracterizada por apresentar uma importante fração celular não-autónoma. Enfatizando as vias alteradas de sinalização entre NM-glia que envolvem inflamação na ELA, dados recentes do nosso laboratório demonstraram que existe uma sobre-activação nas células de microglia N9 quando expostas a exossomas de NMs que sobre-expressam a enzima superóxido dismutase 1 (SOD1) humana com a mutação G93A (NMs SOD1G93A). Além disso, estes NMs mutados e os seus exossomas apresentaram um conteúdo enriquecido em microRNA(miR)-124. Após ter sido provado que internalizam preferencialmente estes exossomas neuronais em comparação com os NMs, as células de microglia N9 apresentaram uma polarização para um estado pró-inflamatório e uma expressão aumentada de miR-124 após incubação com os mesmos, que varia consoante o tempo de incubação. Da mesma forma, fatores solúveis libertados por NMs SOD1G93A produziram efeitos prejudiciais na microglia N9, nomeadamente levaram à sobre-expressão de mediadores pró-inflamatórios e de alarminas, alterações morfológicas bem como da capacidade fagocítica. Tendo em conta os efeitos parácrinos que a sobre-expressão de miR-124 nos NMs tem nas propriedades funcionais da microglia através da influência do secretoma derivado de NMs, antecipamos que o miR- 124 possa ser um mediador crucial na desregulação das propriedades imuno- reguladoras da microglia. Se assim for, a sua correção dirigida para uma expressão normal poderá ter valor terapêutico como modificadora da assinatura homeostática microglial. Globalmente, o objetivo deste trabalho foi investigar se o equilíbrio e a função imune da microglia espinhal eram modificados pelo secretoma de NMs com sobre- expressão de SOD1 humana não mutada (wild-type, WT) ou de NMs SOD1G93A e perceber se tais alterações estariam relacionadas com a sobre-expressão de miR-124. Como os miRNAs têm vindo a ser progressivamente associados a vias desreguladas da patogénese da ELA, explorámos em primeiro lugar de que forma a modulação do miR- 124 em NMs WT e doentes modificaria a assinatura do secretoma no conteúdo em miRNAs associados à inflamação, de forma a estabelecer a influência parácrina que o secretoma do NMs poderá ter nos fenótipos ativados da microglia. De seguida, tivemos interesse em clarificar as diferenças entre as respostas microgliais face ao secretoma de NMs WT e de NMs mutados, de forma a entender melhor a sua ação imuno- reguladora. Para tal, usámos culturas de microglia isolada da medula espinhal de ratinhos com 8 dias de idade e avaliámos vários mediadores funcionais e inflamatórios após a incubação com secretoma de NMs WT e SOD1G93A, de forma a dissecar as diferenças entre as respostas da microglia WT e microglia SOD1G93A. Tendo em conta os nossos resultados anteriores que indicaram os benefícios anti-inflamatórios da modulação do miR-124 nos NMs SOD1G93A em células da linha celular de microglia N9, o nosso objetivo principal passou por validar tais dados nas culturas primárias de microglia obtidas a partir da medula espinhal do murganho transgénico, visto que se aproximam mais das condições in vivo. O desenho experimental envolveu ratinhos WT e SOD1G93A com 8 dias de idade, de onde se isolou a medula espinhal para obtenção de culturas primárias gliais mistas. Estas células foram mantidas durante 21 dias em cultura (in vitro, DIV), altura em que foi feita uma tripsinização suave para remover a camada superior de astrócitos. As células de microglia que permaneceram aderidas foram usadas após 2 DIV. Paralelamente, os NMs WT e SOD1G93A foram semeados e diferenciados. Após 1 dia de diferenciação, os NMs SOD1G93A foram transfetados com anti-miR-124. Adicionou- se meio de diferenciação fresco após 12 h e as células transfetadas foram mantidas por mais 48 h. Os secretomas de NMs WT, SOD1G93A e SOD1G93A anti-miR-124 foram recolhidos aos 4 DIV e incubado em células microgliais durante 4 h e 24 h. Em relação à assinatura de miRNAs, os nossos dados demonstraram que os NMs SOD1G93A são caracterizados por um perfil específico, com aumento de miR-124 e miR-125, bem como diminuição da expressão do miR-146a/miR-21. O conteúdo celular de miRNAs exibido nos NMs mutados foi inteiramente recapitulado no seu secretoma, com exceção do miR-125b, sugerindo que este miRNA é retido por estas células. Estes efeitos foram revertidos nos NMs SOD1G93A transfetados com anti-miR-124 e refletidos de maneira semelhante no seu secretoma, validando o miR-124 como um catalisador para a desregulação dos miRNA. Relativamente à influência exercida pelo secretoma neuronal, a microglia WT e SOD1G93A responderam de maneira semelhante aos fatores solúveis libertados pelos NMs WT. Ambas as células exibiram uma diminuição na expressão de marcadores inflamatórios após 24 h de incubação, bem como alterações em marcadores relacionados com a funcionalidade, sugerindo que este secretoma tem uma ação imunossupressora, que é mais eficaz na microglia SOD1G93A. Por outro lado, provámos que o secretoma dos NMs SOD1G93A tem um impacto agudo e imuno- estimulante na microglia espinhal WT após 4 h de incubação, induzindo um aumento dos níveis de mRNA de marcadores pró-inflamatórios e expressão diminuída de proteínas envolvidas na fagocitose e comunicação intercelular. Em contraste, estes mesmos marcadores associados à inflamação encontraram-se diminuídos na microglia SOD1G93A exposta ao secretoma de NMs SOD1G93A, indicando a sua incapacidade de criar uma resposta reparadora. Como antecipámos que o aumento do miR-124 nos NMs SOD1G93A está, pelo menos, parcialmente associado a um secretoma indutor de alterações fenotípicas aberrantes nas células de microglia, os nossos resultados xv seguintes foram dirigidos à avaliação dos efeitos regenerativos da microglia face a um secretoma de NMs SOD1G93A com expressão de miR-124 diminuída. De facto, esta modulação foi eficaz em prevenir o aumento de iNOS, IL-1β, IL-18 e HMGB1 observado nas células de microglia WT tratadas com secretoma de NMs doentes e não-modulados. Desta forma, podemos concluir que a diminuição da expressão do miR-124 neuronal tem efeitos parácrinos na recuperação da função imunológica adequada da microglia. De uma forma geral, este trabalho destaca o impacto que os NMs e o seu secretoma têm no equilíbrio imune e na disfunção microglial no contexto da ELA, representando os fenótipos heterogéneos e principalmente inflamatórios da microglia. Os nossos resultados apontam, pela primeira vez, para os benefícios da diminuição da expressão do miR-124 em NMs SOD1G93A como uma estratégia para amenizar a ativação parácrina da microglia e a neuroinflamação associada à ELA, usando o modelo de ratinho SOD1G93A. Estudos futuros serão realizados para validar estes dados em NMs e células de microglia geradas de doentes com a forma familiar e esporádica de ELABrites, Dora Maria Tuna de OliveiraCastro, Cláudia Alexandra dos Santos Valente deRepositório da Universidade de LisboaColaço, Ana Rita Ambrósio2023-06-30T00:30:59Z2020-06-302020-06-30T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/51879TID:202504719enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:56:53Zoai:repositorio.ul.pt:10451/51879Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:03:06.609151Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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