Ex vivo expansion of human Tfh-like cells from blood and inflammatory environments

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Monteiro, Inês Filipa Pais
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/43553
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
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spelling Ex vivo expansion of human Tfh-like cells from blood and inflammatory environmentsFollicular helper T cellsTfh cell heterogeneityCell expansionFunctional analysisTeses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019Follicular helper T cells (Tfh) are essential components of the adaptive immune system. Interactions between Tfh and B cells play an essential part in humoral immunity, given that this T cell subset is characterized by their B cell helper activity, provision of B cell differentiation signals and formation and maintenance of germinal centers (GCs) within secondary lymphoid organs. Tfh cells have been associated with a variety of diseases, including infectious and inflammatory diseases. Dysregulated Tfh proliferation and cell function have been correlated with contribution to the pathogenesis or poor prognosis of certain autoimmune diseases over the past decade. On the other hand, the presence of Tfh-like cells in breast cancer has also been linked to protective functions. Thus, despite advances in the study of Tfh cell biology, a lack of understanding remains regarding Tfh-like cell subpopulations recently identified in disease conditions. The present study aimed to expand a PD-1+HLA-DR+ CD4+ Tfh-like subpopulation ex vivo in order to define optimal proliferation conditions and functionally analyze expanded cells. Several cell culture conditions were tested, using different concentrations of anti-CD28 and cytokine combinations, to induce differentiation of healthy human CD4+ T cells into PD-1+HLA-DR+ Tfh-like cells. The differentiated population expressed the Tfh markers Bcl-6 and IL-21, confirming a Tfh-like gene signature. Furthermore, expanded cells appeared to display a phenotype relatable to that of Tfh-like subpopulations formerly identified and associated with pathogenic and defensive roles in rheumatoid arthritis and breast cancer, respectively. More specifically, PD-1+HLA-DR+ CD4+ T cells exhibited production of the cytokines IL-10, IFN-γ and TNF-α, as well as the expression of the transcription factors T-bet and Foxp3. These findings suggest the potential of ex vivo generated Tfh-like cells to exert functions analogous to resembling cells characterized in vivo. The relevance of this study lies in the possibility for ex vivo expansion to consist in a useful tool to induce in vivo expansion in certain types of cancer, when linked to protective function. Otherwise, this approach allows knowledge extension regarding pathogenic populations emerging from autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis. In conclusion, this work evidences the need to further research Tfh function, presents future directions and provides perspective on factors to be considered that might ultimately contribute to the development of novel therapeutic strategies targeting Tfh-like cells.As células T auxiliares foliculares (Tfh) são um subtipo de células T CD4+ de memória caracterizadas pela expressão de CXCR5, PD-1, ICOS, IL-21 e do seu fator de transcrição chave, Bcl-6, que se localizam principalmente nos centros germinativos (GCs) de órgãos linfoides secundários. No entanto, estas células T CD4+ CXCR5+ também podem ser encontradas no sangue periférico humano, sendo referidas como células Tfh circulatórias (cTfh). Devido à atividade auxiliar que caracteriza as células Tfh, em conjunto com o fornecimento de sinais de diferenciação a linfócitos B e a sua necessidade para a formação e manutenção de GCs nos órgãos linfoides secundários, as interações entre células Tfh e células B desempenham um papel essencial na imunidade humoral. Desde a sua descoberta, as células Tfh têm sido associadas a diversas doenças, incluindo doenças infeciosas e inflamatórias. A desregulação na proliferação e função celular das células Tfh tem sido correlacionada com a contribuição destas células para a patogénese ou mau prognóstico de certas doenças autoimunes ao longo da última década. Por outro lado, a presença de células semelhantes a Tfh (Tfh-like) no cancro da mama também tem sido associada a funções protetoras. Assim, apesar dos avanços no estudo da biologia de células Tfh, ainda existe uma escassez de conhecimento relativamente a subpopulações de células Tfh-like. O presente estudo teve como objetivo expandir uma subpopulação de células Tfh-like CD4+ PD-1+HLA-DR+ ex vivo, a fim de definir as suas condições ótimas de proliferação e de analisar funcionalmente as células expandidas. Este fenótipo Tfh-like foi escolhido devido à prévia evidência de que uma população de células T CD4+ PD-1hi que co-expressam o complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC II), onde se insere o marcador de ativação tardia de células T, HLA-DR, se encontravam expandidas no sangue periférico de pacientes com artrite reumatoide soropositiva e a redução dessas células correlacionou-se com uma redução na atividade da doença. Numa primeira fase, células T CD4+ foram isoladas por separação magnética a partir de amostras de sangue de dadores saudáveis. De forma a induzir a diferenciação das células T CD4+ em células Tfh-like PD-1+HLA-DR+, diversas condições de cultura celular foram testadas, utilizando diferentes concentrações de anti-CD28 e diferentes condições de estimulação de citoquinas. Foram testadas as concentrações de 2, 5 e 10 μg/mL de anti-CD28 a fim de alcançar condições adequadas de proliferação para o desenvolvimento de células Tfh-like, uma vez que foi demonstrado que o aumento na concentração de anti-CD28 em combinação com uma elevada concentração de anti-CD3 poderia levar ao aumento da ativação de células T. O aumento nos níveis de expressão da molécula PD-1 exibido pelas células T CD4+ de memória PD-1+HLA-DR+ com a adição das citoquinas TGF-β e IL-6 ao meio de cultura, em combinação com um ligeiro aumento na percentagem destas células, foram fatores determinantes para a seleção da concentração de 5 μg/mL para o anti-CD28. Quando os níveis de expressão de CXCR5 foram medidos nesta condição, foi evidente a escassez de células PD-1+HLA-DR+ CXCR5+ antes e após a cultura celular, pelo que a presença deste recetor não foi considerada uma característica importante para a definição do fenótipo Tfh-like expandido. Esta observação está de acordo com estudos previamente realizados em que foram identificadas diversas populações de células Tfh-like CXCR5- em tecidos inflamados não-linfoides. As condições de estimulação de citoquinas testadas foram baseadas em estudos prévios onde as citoquinas TGF-β, IL-6, IL-12, IL-21, IL-23, IL-27 foram utilizadas para induzir a diferenciação de células com um fenótipo Tfh-like. Quando as células T CD4+ foram cultivadas na presença de TGF-β e IL-21 ou TGF-β em conjunto com IL-6 e IL-21, verificou-se uma expansão ligeiramente mais percetível das células PD-1+HLA-DR+. Também foi observada uma tendência para o aumento dos níveis de expressão de PD-1 em comparação com as condições de estimulação sem estas citoquinas presentes. Tendo estes resultados em conta, estas foram as condições de estimulação selecionadas. Todas as condições de estimulação testadas foram conduzidas na presença da citoquina IL-2. Apesar desta citoquina ser reconhecida como um potente inibidor da diferenciação de células Tfh, comprometendo a manutenção ou sobrevivência de células T que se encontram a divergir na direção da via de diferenciação Tfh, na ausência desta citoquina não foi possível identificar células vivas na população de linfócitos obtida ao fim de 5 dias de cultura celular. Esta observação sugere que as células T CD4+ não sobreviveram num meio deficiente em IL-2. Em adição a esta citoquina, a presença de anti-CD3 e anti-CD28 também foi incluída em todas as condições de estimulação, de forma a mimetizar o processo in vivo de ativação de células T onde são necessários a ativação do complexo TCR, do qual proteínas CD3 fazem parte, e sinais de co-estimulação. Após diferenciação das células nas condições de polarização selecionadas, foi efetuada uma análise à expressão de marcadores de células Tfh, nomeadamente o fator de transcrição repressor Bcl-6 e a citoquina IL-21, confirmando uma assinatura genética semelhante à de células Tfh. Além disso, as células resultantes desta expansão exibiram um fenótipo relacionado com o de subpopulações de células Tfh-like recentemente identificadas e associadas a papéis patogénicos e defensivos na artrite reumatoide e no cancro da mama, respetivamente. Mais especificamente, as células T CD4+ PD-1+HLA-DR+ obtidas exibiram produção das citoquinas IL-10, IFN-γ e TNF-α, bem como a expressão dos fatores de transcrição T-bet e Foxp3. Estes resultados, complementados por evidências reportadas em estudos anteriores que relacionam funções das citoquinas analisadas neste trabalho com a artrite reumatoide e/ou o cancro da mama, sugerem o potencial das células Tfh-like geradas ex vivo para a execução de funções análogas às das células Tfh-like caracterizadas in vivo. É também importante referir que foi verificada a ausência de relevância estatística relativa às diferentes percentagens de células produtoras de citoquinas obtidas entre todas as condições de estimulação testadas, o que indica que as células expandidas partilham uma única assinatura genética que se traduz também na partilha de uma única funcionalidade. Esta hipótese foi confirmada pela falta de relevância estatística que também se identificou nos resultados adquiridos na análise à expressão dos fatores de transcrição Bcl-6, T-bet e Foxp3. Este trabalho contribui positivamente para a área abrangida neste estudo na medida em que foi demonstrado que a expansão ex vivo de células Tfh-like facilita o estudo de novas subpopulações que surgem em diversas condições de doença. Existe também a possibilidade da expansão ex vivo da subpopulação de células Tfh-like CD4+ PD-1+HLA-DR+ consistir numa ferramenta de investigação útil com o objetivo de induzir a expansão in vivo destas células em certos tipos de cancro, caso estudos futuros permitam relacionar esta população de células a uma função protetora. Caso contrário, esta abordagem experimental poderá permitir o aprofundamento do conhecimento sobre populações patogénicas emergentes de doenças autoimunes, como a artrite reumatoide. No entanto, existe a necessidade de realização de análises fenotípicas adicionais em estudos futuros com vista a confirmar se as células aqui geradas são mais propensas a desempenhar funções associadas a um papel protetor ou detrimentoso. Em conclusão, este trabalho evidencia a necessidade de investigação adicional relativamente à função de células Tfh para definir a sua absoluta função em contexto de doença. São também apresentadas direções futuras e perspetivas sobre os fatores a serem considerados, de forma a superar limitações do sistema identificadas neste trabalho, e e que podem contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas direcionadas às células do tipo Tfh.The studies presented in this thesis were performed at CEDOC-NMS/UNL – Centro de Estudos de Doenças Crónicas, NOVA Medical School, Universidade NOVA de Lisboa, under the scientific supervision of PhD Sofia Arriaga CerqueiraCerqueira, Sofia Isabel Arriaga MimosoPereira, José Miguel AzevedoRepositório da Universidade de LisboaMonteiro, Inês Filipa Pais2020-05-13T21:33:56Z2019-12-132019-11-222019-12-13T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/43553TID:202382150enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:44:04Zoai:repositorio.ul.pt:10451/43553Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:56:20.181577Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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