Campylobacter (pro)phages: comparative genomics and development of phage enzybiotics

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Tanoeiro, Luís Vitorino de Azevedo Godinho Pereira
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/47738
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021
id RCAP_1c95f5762707602077fd4db64e921470
oai_identifier_str oai:repositorio.ul.pt:10451/47738
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository_id_str 7160
spelling Campylobacter (pro)phages: comparative genomics and development of phage enzybioticsCampylobacterResistência a antibióticosProfagosEnzibióticosIntrogressãoTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021A campylobacteriose é a doença gastrointestinal e a zoonose humana mais reportada na União Europeia, originando enormes impactos sanitários, sociais e económicos. Os sintomas incluem diarreia, dores abdominais e/ou febre, e apesar destes durarem apenas alguns dias, as sequelas pós-infecção podem incluir síndrome de Guillain-Barré, artrite reactiva ou doença inflamatória do intestino. As bactérias Gram-negativas Campylobacter coli e C. jejuni são os agentes causadores de campylobacteriose mais reportados, e apesar do uso de antibióticos em casos de campylobacteriose ser restrito a grupos específicos, a tendência crescente de resistência entre isolados destas espécies, especialmente a ciprofloxacina, é extremamente preocupante. De entre as várias potenciais soluções para este problema, as lisinas codificadas por fagos aparecem na primeira linha das mais promissoras armas contra a resistência a antibióticos. As lisinas são enzimas típicas de bacteriófagos que hidrolisam o peptidoglicano bacteriano. No ciclo lítico de infecção bacteriofágica, as lisinas estão ligadas à libertação da descendência por promoverem a lise osmótica do hospedeiro após a replicação e montagem fágicas. Tipicamente pequenas (15-40 kDa) e modulares, as lisinas tendem a ser bastante eficientes, podendo apresentar especificidade ao nível de espécie ou até mesmo de estirpe. Várias estratégias têm sido desenvolvidas no sentido de melhorar a actividade das lisinas e o seu espectro de acção. Apesar da potencialidade das endolisinas no combate à resistência a antibióticos, só se identificaram profagos em genomas de Campylobacter spp. a meio da década passada e, correntemente, ainda não existem muitos bacteriófagos de Campylobacter spp. descritos. A identificação de novos profagos e lisinas é, então, um trabalho da maior importância e para o qual devem ser movidos esforços. Um conjunto de 22 genomas de C. jejuni e 82 genomas de C. coli foi recentemente sequenciado no âmbito deste trabalho. Aqui, utilizámos ferramentas bioinformáticas para identificar regiões profágicas nestes genomas. Durante esta análise, uma região promissora foi identificada em C. coli Cco1598. A revisão detalhada desta região aponta para a identificação do profago Cco1598. Este profago presente em isolados de C. coli parece estar incompleto e ser um homólogo ainda não reportado do profago CJIE2 (do inglês, Campylobacter jejuni integrated element 2) que se encontra presente em C. jejuni. Estudos de indução são necessários para melhor entender a biologia do profago Cco1598, bem como o seu impacto no hospedeiro. Nas restantes regiões profágicas detectadas e num conjunto de 66 genomas de bacteriófagos de Campylobacter spp. disponíveis para livre acesso, foram identificadas 47 endolisinas putativas distintas com potencial biotecnológico. Quatro das lisinas identificadas – duas identificadas nos genomas recentemente sequenciados e duas identificadas em genomas de bacteriófagos -, tal como a lisina Cje_EndoPepM15 anteriormente identificada no nosso laboratório, foram escolhidas como candidatos promissores com estruturas previstas significativamente distintas. As sequências codificantes foram optimizadas para expressão em Escherichia coli, clonadas em vectores de expressão e submetidas a análises laboratoriais tendo em vista o desenvolvimento de enzibióticos. A expressão em E. coli levou à produção de três das lisinas identificadas. Uma delas, Cje_Goose, é produzida em corpos de inclusão e várias condições foram testadas para futura obtenção de quantidades e volumes apreciáveis de enzima solúvel. Apenas duas, Cje_EndoPepM15 e Cje_Lysozyme, foram obtidas em volumes e concentrações apreciáveis. Apesar das várias condições testadas, as duas lisinas identificadas em genomas de bacteriófagos causaram a estagnação e redução da densidade óptica dos hospedeiros de expressão após indução, e não puderam ser avaliadas como potenciais enzibióticos. As três lisinas purificadas demonstraram actividade bactericida directa contra a bactéria Gram-positiva Micrococcus luteus, e actividade hidrolítica indirecta em preparados celulares das bactérias Gram-negativas C. coli 817, C. jejuni 3625 e E. coli RR1. Isto confirma o potencial biotecnológico das lisinas identificadas como armas contra isolados resistentes a antibióticos com um amplo espectro de acção. A aplicação de endolisinas em bactérias Gram-negativas é dificultada pela membrana externa que protege o peptidoglicano da actividade hidrolítica das lisinas fágicas. Neste trabalho, tentámos utilizar a encapsulação das lisinas Cje_EndoPepM15 e Cje_Lysozyme em lipossomas como estratégia para ultrapassar essa barreira. Formulações lipídicas não tóxicas foram testadas, mas não se obtiveram eficiências de incorporação satisfatórias. Não foi detectada actividade bacteriolítica após aplicação de quantidades subóptimas de lisinas encapsuladas contra isolados de Campylobacter spp.. Trabalhos complementares são necessários tendo em vista a transformação das lisinas produzidas em armas efectivas contra isolados de Campylobacter spp. resistentes a antibióticos. Os genomas recém-sequenciados foram submetidos a tipagem molecular recorrendo ao esquema de MLST descrito para isolados de Campylobacter spp.. Confirmando a variabilidade dos genomas de Campylobacter spp., esta tipagem resultou na identificação de duas novas variantes alélicas e oito novos perfis alélicos em onze isolados de C. coli. As novas variações alélicas e novos perfis foram submetidas à base de dados pública para tipagem molecular e diversidade genómica microbiana, PubMLST. Capazes de transformação natural e com um genoma plástico e dinâmico, além de resistência a antibióticos, C. coli e C. jejuni têm sido descritas como estando a passar por eventos de introgressão, i.e. a transferência de material genético entre espécies diferentes, com alguns isolados a compartilharem perto de um quarto do seu genoma, com a consequente partilha de mecanismos moleculares e características fenotípicas coincidentes entre isolados de espécies diferentes. Posto isto, colocámos a hipótese de que bacteriófagos de Campylobacter spp. têm capacidade de realizar saltos entre hospedeiros destas duas espécies, contribuindo para o processo de introgressão. Profagos idênticos ao profago Cco1598 e aos profagos de referência CJIE1 e CJIE4 foram identificados na população de Campylobacter spp. e analisados em relação aos locais de inserção, ao tamanho e cobertura dos fagos-modelo, e em termos de filogenia fágica. A análise dos locais de inserção dos fagos identificados demonstrou que fagos idênticos a CJIE4 e ao profago Cco1598 possuem locais de inserção relativamente conservados. Fagos idênticos a CJIE1 possuem locais de inserção variados, consistente com a capacidade de integração aleatória anteriormente descrita. Comparações de tamanho e cobertura dos profagos identificados sugerem diferenças entre profagos de C. coli e de C. jejuni, apontando para a aquisição destes profagos previamente ao evento de especiação das duas espécies. A análise filogenética confirmou a identidade do profago Cco1598 como homólogo próximo do elemento genético CJIE2. Observações pontuais em profagos idênticos a CJIE4 e ao profago Cco1598 aqui identificado sugerem que saltos bacteriofágicos entre hospedeiros parecem ocorrer no contexto de C. jejuni e C. coli, ainda que sejam fenómenos raros. A generalidade dos resultados aponta para que os profagos estudados tenham sido maioritariamente adquiridos antes do evento de especiação, e evoluído depois em conjunto com o genoma do hospedeiro bacteriano. Estudos adicionais são necessários para clarificar a existência e o papel dos saltos fágicos entre hospedeiros no processo de introgressão. Vários genes com interesse biotecnológico foram rastreados nos profagos identificados. O profago CJIE2, bem como alguns profagos idênticos a CJIE4 e Cco1598, transportam uma endolisina putativa não detectada previamente, representando uma nova fonte de potencial no combate à resistência a antibióticos, e que deve ser submetida a análises laboratoriais. Paralelamente, os genes dns e nucA foram identificados nos fagos encontrados e analisados. Estes genes integram o genoma fágico e codificam para endonucleases extracelulares inibidoras da transformação natural em Campylobacter spp., que potencialmente modula os eventos de introgressão. É interessante que no contexto de profagos idênticos a CJIE1, genes completos são encontrados em profagos de C. jejuni, enquanto que em profagos de C. coli encontram-se maioritariamente versões parciais dos mesmos. Esta realidade pode ser explicativa da aparente direccionalidade dos eventos de introgressão de C. jejuni para C. coli. Um estudo mais detalhado da distribuição destes genes na população de Campylobacter spp. e avaliação da sua actividade são necessários para clarificar o impacto destas endonucleases codificados por fagos no processo de introgressão em curso.Campylobacteriosis is the most reported gastrointestinal disease and human zoonosis in the European Union leading to huge health, social and economic impacts. Gram-negative bacteria Campylobacter coli and C. jejuni are the major reported causing agents of campylobacteriosis, and the increasing trends of antibiotic resistance among them are extremely concerning. Phage-encoded lysins are peptidoglycan hydrolysing enzymes that appear in the frontline of the most promising weapons against antibiotic resistance. However, not many Campylobacter spp. bacteriophages have been described so far and identification of new prophages and lysins is of major interest. Furthermore, C. coli and C. jejuni are described to be undergoing introgression events, i.e. the transference of genetic material between different species, with some isolates sharing almost a quarter of its genome. We hypothesize that Campylobacter spp. phages can perform host-jumps between these two species, both contributing and being consequence of introgression events. In this study we identified 47 distinct putative endolysins in prophage-predicted regions. Simultaneously, Cco1598 prophage, a not yet reported C. coli homolog of Campylobacter jejuni integrated element (CJIE2), was identified. Four of the identified lysins, as well as the previous inhouse identified lysin Cje_EndoPepM15, were submitted to wet lab analysis for enzybiotics development. We were able to produce three of them, with all having bacteriolytic activity, although one of them was produced in inclusion bodies and only two could be recovered in workable volumes and concentrations, yet. Delivery of endolysins to Gram-negative bacteria peptidoglycan is difficulted by the protecting outer membrane. Here, we attempt to use liposome-encapsulation to overcome this issue. No bacteriolytic activity was found in liposome-encapsulated lysins against Campylobacter spp. isolates. Complementary work is necessary in order to transform the produced lysins in really effective weapons against antibiotic resistant Campylobacter spp. isolates. Cco1598-like prophages, as well as CJIE1- and CJIE4-like prophages, were identified in the Campylobacter spp. population and analysed in terms of phages insertion sites, phages length and model coverage, and phages phylogeny. Punctual observations suggest that bacteriophage host-jumps, although rare, are occurring in the context of C. jejuni and C. coli. General results support that the prophages studied were mainly acquired previous to speciation, then evolving jointly with host bacterium genome. Further studies are required to better clarify the role of bacteriophage host-jumps as both contributor and consequence of introgression events.Vale, Filipa F.Caeiro, Filomena,1950-Repositório da Universidade de LisboaTanoeiro, Luís Vitorino de Azevedo Godinho Pereira2022-12-25T01:31:14Z202120202021-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/47738TID:202934373enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:50:52Zoai:repositorio.ul.pt:10451/47738Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:59:44.301875Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
dc.title.none.fl_str_mv Campylobacter (pro)phages: comparative genomics and development of phage enzybiotics
title Campylobacter (pro)phages: comparative genomics and development of phage enzybiotics
spellingShingle Campylobacter (pro)phages: comparative genomics and development of phage enzybiotics
Tanoeiro, Luís Vitorino de Azevedo Godinho Pereira
Campylobacter
Resistência a antibióticos
Profagos
Enzibióticos
Introgressão
Teses de mestrado - 2021
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas
title_short Campylobacter (pro)phages: comparative genomics and development of phage enzybiotics
title_full Campylobacter (pro)phages: comparative genomics and development of phage enzybiotics
title_fullStr Campylobacter (pro)phages: comparative genomics and development of phage enzybiotics
title_full_unstemmed Campylobacter (pro)phages: comparative genomics and development of phage enzybiotics
title_sort Campylobacter (pro)phages: comparative genomics and development of phage enzybiotics
author Tanoeiro, Luís Vitorino de Azevedo Godinho Pereira
author_facet Tanoeiro, Luís Vitorino de Azevedo Godinho Pereira
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Vale, Filipa F.
Caeiro, Filomena,1950-
Repositório da Universidade de Lisboa
dc.contributor.author.fl_str_mv Tanoeiro, Luís Vitorino de Azevedo Godinho Pereira
dc.subject.por.fl_str_mv Campylobacter
Resistência a antibióticos
Profagos
Enzibióticos
Introgressão
Teses de mestrado - 2021
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas
topic Campylobacter
Resistência a antibióticos
Profagos
Enzibióticos
Introgressão
Teses de mestrado - 2021
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas
description Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021
publishDate 2020
dc.date.none.fl_str_mv 2020
2021
2021-01-01T00:00:00Z
2022-12-25T01:31:14Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10451/47738
TID:202934373
url http://hdl.handle.net/10451/47738
identifier_str_mv TID:202934373
dc.language.iso.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron:RCAAP
instname_str Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
collection Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository.name.fl_str_mv Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1799134543889825792

Registros relacionados