Identificação de negevírus em mosquitos colhidos no sul de Portugal e análise da sua replicação

• Autor(a) principal: CARAPETA, Sara Sofia Costa
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/18552
• topic: Biologia molecular; Mosquitos; Negevírus; Portugal; Efeitos citopáticos; Análise filogenética; Replicação viral; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

O género Negevirus foi descrito pela primeira vez em 2013, tendo sido proposto como um novo grupo taxonómico de vírus específicos de insetos com uma ampla distribuição geográfica, e caracterizado por uma considerável diversidade de hospedeiros, entre os quais flebótomos do género Lutzomyia e mosquitos, maioritariamente do género Culex mas também Anopheles e Aedes. Em Portugal, a primeira identificação de um negevírus foi obtida de um lote de mosquitos da espécie Oc. caspius, após o seu coisolamento com um flavivírus específico de insetos OCFVPT. A génese dos efeitos citopáticos exuberantes e de desenvolvimento rápido decorrentes da replicação destes vírus em culturas de células de inseto, a sua origem e evolução desconhecidas, as semelhanças de algumas das proteínas que codificam com as de vírus de plantas, e o seu potencial impacto na fitness e/ou na eventual competência vetorial dos insetos em que são encontrados, são questões que têm contribuído para o crescente interesse sobre o estudo destes vírus. No decurso do trabalho que aqui se apresenta foi efetuada a deteção, isolamento e caracterização genética de novos negevírus de mosquitos colhidos no sul de Portugal, tentativamente definida a sua gama de hospedeiros e analisada a sua estratégia de replicação, usando células de inseto mantidas em cultura. Através da utilização de RT-PCR e de primers degenerados (na sua maioria) foi possível identificar novas estirpes de negevírus, presentes em quatro espécies de mosquitos diferentes capturados no sul de Portugal: Ochlerotatus caspius, Cx. pipiens, Cx. theileri e Cx. univittatus. Inferências filogenéticas baseadas no alinhamento de sequências codificantes da polimerase viral, amplificadas de negevírus isolados em culturas de células C6/36, demonstraram a ocorrência de um novo grupo monofilético, filogeneticamente próximo do grupo monofilético do qual constam negevírus de tipo Negev e pertencente ao grupo taxonómico proposto recentemente, Nelorpivirus. A análise da replicação de negevírus in vitro permitiu observar a presença de efeitos citopáticos extensos e de desenvolvimento rápido, embora sem indicação óbvia da entrada das células infetadas em apoptose. Estes vírus comprovaram replicar de forma muito rápida, tendo sido possível detetar genomas virais no sobrenadante de culturas celulares C6/36 infetadas, 4 horas após o início da infeção. Neste trabalho foi também construído um vetor plasmídico, designado pIC111-V, o qual deverá permitir a expressão transitória de proteínas em células de inseto como consequência da presença de um promotor de transcrição de baculovírus reconhecido constitutivamente nestas células. A sua utilização na transfeção de células de inseto revelou poder representar um passo importante na melhoria das metodologias de análise proteómica nestas células.