Identificação de negevírus em mosquitos colhidos no sul de Portugal e análise da sua replicação
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2015 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10362/18552 |
Resumo: | O género Negevirus foi descrito pela primeira vez em 2013, tendo sido proposto como um novo grupo taxonómico de vírus específicos de insetos com uma ampla distribuição geográfica, e caracterizado por uma considerável diversidade de hospedeiros, entre os quais flebótomos do género Lutzomyia e mosquitos, maioritariamente do género Culex mas também Anopheles e Aedes. Em Portugal, a primeira identificação de um negevírus foi obtida de um lote de mosquitos da espécie Oc. caspius, após o seu coisolamento com um flavivírus específico de insetos OCFVPT. A génese dos efeitos citopáticos exuberantes e de desenvolvimento rápido decorrentes da replicação destes vírus em culturas de células de inseto, a sua origem e evolução desconhecidas, as semelhanças de algumas das proteínas que codificam com as de vírus de plantas, e o seu potencial impacto na fitness e/ou na eventual competência vetorial dos insetos em que são encontrados, são questões que têm contribuído para o crescente interesse sobre o estudo destes vírus. No decurso do trabalho que aqui se apresenta foi efetuada a deteção, isolamento e caracterização genética de novos negevírus de mosquitos colhidos no sul de Portugal, tentativamente definida a sua gama de hospedeiros e analisada a sua estratégia de replicação, usando células de inseto mantidas em cultura. Através da utilização de RT-PCR e de primers degenerados (na sua maioria) foi possível identificar novas estirpes de negevírus, presentes em quatro espécies de mosquitos diferentes capturados no sul de Portugal: Ochlerotatus caspius, Cx. pipiens, Cx. theileri e Cx. univittatus. Inferências filogenéticas baseadas no alinhamento de sequências codificantes da polimerase viral, amplificadas de negevírus isolados em culturas de células C6/36, demonstraram a ocorrência de um novo grupo monofilético, filogeneticamente próximo do grupo monofilético do qual constam negevírus de tipo Negev e pertencente ao grupo taxonómico proposto recentemente, Nelorpivirus. A análise da replicação de negevírus in vitro permitiu observar a presença de efeitos citopáticos extensos e de desenvolvimento rápido, embora sem indicação óbvia da entrada das células infetadas em apoptose. Estes vírus comprovaram replicar de forma muito rápida, tendo sido possível detetar genomas virais no sobrenadante de culturas celulares C6/36 infetadas, 4 horas após o início da infeção. Neste trabalho foi também construído um vetor plasmídico, designado pIC111-V, o qual deverá permitir a expressão transitória de proteínas em células de inseto como consequência da presença de um promotor de transcrição de baculovírus reconhecido constitutivamente nestas células. A sua utilização na transfeção de células de inseto revelou poder representar um passo importante na melhoria das metodologias de análise proteómica nestas células. |
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Identificação de negevírus em mosquitos colhidos no sul de Portugal e análise da sua replicaçãoBiologia molecularMosquitosNegevírusPortugalEfeitos citopáticosAnálise filogenéticaReplicação viralDomínio/Área Científica::Ciências MédicasO género Negevirus foi descrito pela primeira vez em 2013, tendo sido proposto como um novo grupo taxonómico de vírus específicos de insetos com uma ampla distribuição geográfica, e caracterizado por uma considerável diversidade de hospedeiros, entre os quais flebótomos do género Lutzomyia e mosquitos, maioritariamente do género Culex mas também Anopheles e Aedes. Em Portugal, a primeira identificação de um negevírus foi obtida de um lote de mosquitos da espécie Oc. caspius, após o seu coisolamento com um flavivírus específico de insetos OCFVPT. A génese dos efeitos citopáticos exuberantes e de desenvolvimento rápido decorrentes da replicação destes vírus em culturas de células de inseto, a sua origem e evolução desconhecidas, as semelhanças de algumas das proteínas que codificam com as de vírus de plantas, e o seu potencial impacto na fitness e/ou na eventual competência vetorial dos insetos em que são encontrados, são questões que têm contribuído para o crescente interesse sobre o estudo destes vírus. No decurso do trabalho que aqui se apresenta foi efetuada a deteção, isolamento e caracterização genética de novos negevírus de mosquitos colhidos no sul de Portugal, tentativamente definida a sua gama de hospedeiros e analisada a sua estratégia de replicação, usando células de inseto mantidas em cultura. Através da utilização de RT-PCR e de primers degenerados (na sua maioria) foi possível identificar novas estirpes de negevírus, presentes em quatro espécies de mosquitos diferentes capturados no sul de Portugal: Ochlerotatus caspius, Cx. pipiens, Cx. theileri e Cx. univittatus. Inferências filogenéticas baseadas no alinhamento de sequências codificantes da polimerase viral, amplificadas de negevírus isolados em culturas de células C6/36, demonstraram a ocorrência de um novo grupo monofilético, filogeneticamente próximo do grupo monofilético do qual constam negevírus de tipo Negev e pertencente ao grupo taxonómico proposto recentemente, Nelorpivirus. A análise da replicação de negevírus in vitro permitiu observar a presença de efeitos citopáticos extensos e de desenvolvimento rápido, embora sem indicação óbvia da entrada das células infetadas em apoptose. Estes vírus comprovaram replicar de forma muito rápida, tendo sido possível detetar genomas virais no sobrenadante de culturas celulares C6/36 infetadas, 4 horas após o início da infeção. Neste trabalho foi também construído um vetor plasmídico, designado pIC111-V, o qual deverá permitir a expressão transitória de proteínas em células de inseto como consequência da presença de um promotor de transcrição de baculovírus reconhecido constitutivamente nestas células. A sua utilização na transfeção de células de inseto revelou poder representar um passo importante na melhoria das metodologias de análise proteómica nestas células.The genus Negevirus, described for the first time in 2013, was proposed as a new taxon of insect specific viruses with wide geographic distribution and characterized by a considerable host diversity, including Lutzomyia sandflies and mosquitoes mostly from the Culex, Anopheles and Aedes genera. In Portugal, the first identification of a negevirus was obtained as a result of its co-isolation with an insect-specific flavivirus, OCFVPT. The genesis of exuberant cytopathic effects and the fast replication of these viruses in insect cell cultures, its source and evolution, the similarities of the proteins they encode with those encoded by plant viruses and the potential impact in the fitness and/or in the possible vector competence of the insects where these virus are found, are questions that fuel the growing interest in the study of these viruses. In this report, detection, isolation and genetic characterization of new negeviruses of mosquitoes collected in the south of Portugal have been made, tentatively defining its host range and analyzing its replication strategy using insect cells maintained in culture. By using RT-PCR and degenerate primers (mostly) it was possible to identify new negeviruses strains, present in four different species of mosquitoes trapped in the south of Portugal: Ochlerotatus caspius, Cx. pipiens, Cx. theileri e Cx. univittatus. Phylogenetic inferences based on alignments of coding sequences of the viral polymerase, amplified from isolated negeviruses in C6/36 cell cultures, showed the occurrence of a new monophyletic group, phylogenetically close to that which contains negeviruses Negev-like and that belongs to the proposed recently, Nelorpivirus taxon. The analysis of negeviruses replication in vitro allowed us to observe the presence of extensive cytopathic effects with fast development, although with no obvious indication that infected cells undergo extensive apoptosis. Viral replication was confirmed to occur quickly, and it was possible to detect viral genomes in the infected C6/36 cell culture supernatant, 4 hours after the onset of infection. In this report, it was also constructed a plasmid vector, designated pIC111-V, which should allow the transient expression of proteins in insect cells, as a consequent of the presence of a baculovirus transcriptional promoter. Its use in transfection of insect cells transfection may be an important step in the improving of the proteomics analysis methodologies in these cells.Instituto de Higiene e Medicina TropicalPARREIRA, RicardoALMEIDA, PauloRUNCARAPETA, Sara Sofia Costa2016-07-27T10:30:43Z201520152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10362/18552TID:201134217porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-11T03:57:48Zoai:run.unl.pt:10362/18552Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:24:49.784957Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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O género Negevirus foi descrito pela primeira vez em 2013, tendo sido proposto como um novo grupo taxonómico de vírus específicos de insetos com uma ampla distribuição geográfica, e caracterizado por uma considerável diversidade de hospedeiros, entre os quais flebótomos do género Lutzomyia e mosquitos, maioritariamente do género Culex mas também Anopheles e Aedes. Em Portugal, a primeira identificação de um negevírus foi obtida de um lote de mosquitos da espécie Oc. caspius, após o seu coisolamento com um flavivírus específico de insetos OCFVPT. A génese dos efeitos citopáticos exuberantes e de desenvolvimento rápido decorrentes da replicação destes vírus em culturas de células de inseto, a sua origem e evolução desconhecidas, as semelhanças de algumas das proteínas que codificam com as de vírus de plantas, e o seu potencial impacto na fitness e/ou na eventual competência vetorial dos insetos em que são encontrados, são questões que têm contribuído para o crescente interesse sobre o estudo destes vírus. No decurso do trabalho que aqui se apresenta foi efetuada a deteção, isolamento e caracterização genética de novos negevírus de mosquitos colhidos no sul de Portugal, tentativamente definida a sua gama de hospedeiros e analisada a sua estratégia de replicação, usando células de inseto mantidas em cultura. Através da utilização de RT-PCR e de primers degenerados (na sua maioria) foi possível identificar novas estirpes de negevírus, presentes em quatro espécies de mosquitos diferentes capturados no sul de Portugal: Ochlerotatus caspius, Cx. pipiens, Cx. theileri e Cx. univittatus. Inferências filogenéticas baseadas no alinhamento de sequências codificantes da polimerase viral, amplificadas de negevírus isolados em culturas de células C6/36, demonstraram a ocorrência de um novo grupo monofilético, filogeneticamente próximo do grupo monofilético do qual constam negevírus de tipo Negev e pertencente ao grupo taxonómico proposto recentemente, Nelorpivirus. A análise da replicação de negevírus in vitro permitiu observar a presença de efeitos citopáticos extensos e de desenvolvimento rápido, embora sem indicação óbvia da entrada das células infetadas em apoptose. Estes vírus comprovaram replicar de forma muito rápida, tendo sido possível detetar genomas virais no sobrenadante de culturas celulares C6/36 infetadas, 4 horas após o início da infeção. Neste trabalho foi também construído um vetor plasmídico, designado pIC111-V, o qual deverá permitir a expressão transitória de proteínas em células de inseto como consequência da presença de um promotor de transcrição de baculovírus reconhecido constitutivamente nestas células. A sua utilização na transfeção de células de inseto revelou poder representar um passo importante na melhoria das metodologias de análise proteómica nestas células. |
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