Studies on the proneural factor Ascl1 in the context of mitotic bookmarking
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| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/39446 |
Resumo: | Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019 |
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Studies on the proneural factor Ascl1 in the context of mitotic bookmarkingAscl1Transcription factorMitotic bookmarkingNuclear localization signal (NLS)Electrostatic interactionsTeses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019Vertebrate neurogenesis is to large extent regulated by bHLH proneural transcription factors (TFs) such as Ascl1 (also known as Mash1). They function as master regulators of neurogenesis, being both necessary and sufficient for the activation of a full program of neuronal differentiation. Ascl1 is expressed in multiple progenitor domains along the anterior/posterior axis of the developing brain and spinal cord. Its expression is restricted to proliferative cells, occurring both in multipotent neural stem cells (NSCs) and intermediate (neuronal committed) progenitors. Ascl1 has been shown to directly regulate multiple stages of neurogenesis, controlling the proliferation of NSCs, their commitment towards the neuronal lineage, and also later steps such as migration and differentiation. The master regulatory function of Ascl1 results, to large extent, from its pioneer factor ability - binding to its target sites within nucleosomal DNA and promoting chromatin accessibility. While extensively studied in neural development and reprogramming fields, no studies have so far investigated this important TF in the context of mitotic bookmarking. This is a relatively novel concept examining the ability of certain transcriptional regulators (including TFs) to associate with condensed chromosomes during mitosis, and how this may function to convey gene regulatory information to newly formed daughter cells. The association of TFs with mitotic chromatin has been attributed to both sequence-specific and non-specific electrostatic interactions. Moreover, and given their ability to target genomic sites within nucleosomal (more condensed) chromatin, pioneer TFs have been proposed to have inherent mitotic bookmarking activity. The goal of this work was to address a putative mitotic bookmarking function of Ascl1, and investigate how its interaction with condensed chromatin may be regulated. It started from live-cell imaging observations generated in our group, showing a transcriptionally active Ascl1-eGFP fusion protein to be excluded from mitotic chromosomes, suggesting Ascl1 does not have the ability to interact with condensed chromatin during mitosis, and failing to support a function in mitotic bookmarking. Fluorescent proteins are bulky and can potentially disrupt or alter the natural behavior of the protein to which they are fused with. To investigate the possibility that GFP is hindering Ascl1 from binding mitotic chromatin, we tagged Ascl1 with a tetracysteine (TC)-tag sequence composed of merely 6 or 12 amino acids. While TC-Ascl1 protein constructs proved too unstable to be labeled by the TC-ReAsH system, stabilizing Ascl1 through a tether construct with its heterodimeric partner, E47, allowed the successful ReAsH labeling of Ascl1 and the observation of its exclusion from the mitotic chromatin, corroborating results obtained with GFP fusions. Previous published studies have proposed the nuclear import machinery to have a role in regulating TF-chromatin association in mitosis, whereby a concentration gradient of Ran-GTP would guide proteins bearing a positively charged nuclear localization sequence (NLS) to the chromatin vicinity. To investigate the importance of the nuclear import machinery in the interaction of TFs with mitotic chromosomes, two bookmarking TFs (Brn2 and Rbpj) were live-imaged in cells subjected to disruption of the nuclear import machinery. This was achieved through the use of a small molecule that inhibits the function of importin-β (importazole), or by disrupting the Ran-GTP gradient with co-expression of dominant-negative and dominant-active Ran mutants. Neither of the methods used however, provided any evidence supporting a role for the nuclear import machinery in mitotic bookmarking. To investigate how previous observations implicating the nuclear import machinery could result from an importin-independent function of the NLS based on electrostatic interactions, a series of eGFP-NLS constructs, varying in electrostatic potential and nuclear import ability were generated. These were tested in live imaging experiments in transfected cells. The concatenation of three highly charged SV40NLS sequences fused to GFP (3xSV40NLS) was highly enriched at mitotic chromatin, while GFP alone was excluded. Furthermore, a highly charged SV40NLS mutant with abolished NLS-import capability (3xSV40NLS KA) that was almost completely excluded from the nucleus in interphase, remained highly enriched at mitotic chromatin. These results strongly suggest the contribution of the NLS to mitotic chromatin enrichment results from its ability to mediate electrostatic interactions with the negatively charged chromatin, and not due to an importin-dependent mechanism. Mitotic entry is accompanied by hyper-phosphorylation of the transcriptional machinery, inducing the degradation or inactivation of general and sequence-specific TFs. Previous results from our lab found that overexpression of GFP fusions of a non-phosphorylable Ascl1 with serine to alanine mutations in phosphoacceptor (SP) sites outside its DNA-binding domain (DBD) (Ascl1-6SA), and the DBD of Ascl1 alone (lacking both N and C terminal domains), were still excluded from mitotic chromatin. Given that GFP fusions of both these derivatives may not possess the necessary electrostatic potential to interact with mitotic chromatin in the first place, a series of such Ascl1 derivatives were fused to 3xSV40NLS sequence in order to reveal the potential effects of post translational modifications on Ascl1 exclusion. Altogether, our results using live-imaging suggest that phosphorylation of SP sites located outside the DBD of Ascl1 may negatively influence the ability of this TF to interact with mitotic chromatin. In conclusion, results gathered in this work support the emerging idea in the field that non-specific DNA binding, mediated by electrostatic interactions, plays a large part in the colocalization of TFs with mitotic chromosomes. Moreover, these findings go strongly against the common association between pioneer and mitotic bookmarking activities found in the literature. Further experimentation should validate our observations with Ascl1 in an in vivo context, surveying the activity of this important TF in mitotic events associated with both proliferative and neurogenic divisions.Fatores de transcrição (FT) proneurais da familia bHLH, como o Ascl1 (também conhecido como Mash1) têm um papel essencial na regulação da neurogénese de vertebrados. Estes fatores são considerados reguladores mestres de neurogénese, sendo ambos necessários e suficientes para a ativação da expressão do programa de diferenciação neuronal. Ascl1 é expresso em múltiplos domínios de células progenitoras ao longo do eixo anterior/posterior do cérebro e medula espinal durante o desenvolvimento embrionário. A expressão deste fator é restrita a células proliferativas - em células estaminais neurais (NSCs) multipotentes e progenitores intermediários (neuronais) já compromitidos a diferenciarem-se em neurónios. Ascl1 regula diretamente várias fases da neurogénese, promovendo a proliferação de células estaminais neurais, bem como a sua transição em neurónios, e subsequente diferenciação. A função de regulador mestre do Ascl1 é atribuida à sua função como fator “pioneiro”, ou seja, à sua capacidade de reconhcer os seus locais de ligação quando estes estão presentes em cromatina menos acessível, promovendo a acessibilidade a regiões genómicas específicas. Enquanto vários estudos têm investigado o Ascl1 no contexto da neurobiologia do desenvolvimento e reprogramação neuronal, este fator proneural ainda não foi analisado no contexto de “bookmarking” mitótico. Este é um conceito relativamente recente que estuda a função de fatores de transcrição que têm a capacidade de interagirem com os cromossomas durante a mitóse, que se pensa desta forma funcionarem como “bookmarkers” de génes activos em interfase, transmitindo informaçao reguladora às células filhas. Devido à capacidade que fatores pioneiros possuem para aceder a regiões de cromatina compactada, tem sido proposto que estes fatores possivelmente também interagem com cromatina mitótica condensada. Esta hipótese é particularmente relevante, dado que alguns fatores pioneiros que até agora revelaram capacidade de bookmarking mitótico também têm um papel importante na programação celular durante o desenvolvimento embrionário, sugerindo que a reativação de genes após a saída de mitose pode recapitular os processos hierárquicos pelos quais diferentes tipos de células são especificados. Este projecto teve como objectivo investigar uma possível função de “bookmarking” mitótico do Ascl1, e também analisar os mecanismos que regulam a sua interacção com a cromatina durante a mitose. Teve como ponto de partida resultados de microscopia ”live imaging” que mostram que uma proteína de fusão Ascl1-eGFP (que mantem a sua actividade transcripcional), está excluída dos cromosomas durante a mitose, sugerindo que este factor não possui actividade de “bookmarking” mitótico. Proteínas de fusão com GFP são significativamente maiores que a proteínas nativas podendo, por isso, ter o seu comportamento alterado quando comparado com a proteína nativa. Para investigar a possibilidade de que a proteína GFP esteja a impedir o Ascl1 de interagir com cromatina durante a mitose, foi geradas proteínas de fusão entre o Ascl1 e uma sequência de tetracisteínas (TC) composta por apenas 6 ou 12 aminoácidos. A primeira proteína gerada (TC-Ascl1) não possuía a estabilidade necessária para ser detetada pelo sistema TC-ReAsH. A estabilização do Ascl1, foi então, conseguida através da criação de uma proteína em que este é expresso em fusão com o seu parceiro heterodimérico (E47). Com esta estratégia, a sua detecção foi possível usando o marcador ReAsH, tendo sido observado a sua exclusão da cromatina mitótica. Estes resultados vieram assim corroborar os dados anteriores obtidos com as fusões de GFP. Estudos recentes sugerem que o mecanisnmo de importação nuclear atua como um mecanismo que desempenha um papel importante na associação de fatores de transcrição com a cromatina condensada em mitose, em que um gradiente de concentração de Ran-GTP guiaria as proteínas que possuem uma sequência de localização nuclear (NLS), contendo multiplos resíduos carregados positivamente, para a proximidade dos cromossomas. Para investigar a importância deste mecanismo de importação nuclear na interação de fatores de transcrição com a cromatina em mitose, foi feito “live imaging” com dois bookmarkers mitóticos (Brn2 e Rbpj) após pertubação do mecanismo de importação nuclear através do uso de uma pequena molécula que inibe a função da importina-β (i.e., importazole), ou através da perturbação do gradiente RanGTP por co-expressão de mutantes de Ran. Nenhum dos métodos usados para quebrar o gradiente de RanGTP afetou a capacidade do Brn2 ou Rbpj interagir com a cromatina durante a mitose. Com o objectivo de investigar se os resultados anteriores, que apontavam para um papel do mecanismo de importação nuclear, poderiam dever-se a uma função do NLS independente das importinas, foram geradas diversas sequências de NLS, variando em potencial eletrostático e capacidade de importação nuclear. As imagens de microscopia “live imaging” revelaram que a concatenação de três sequências de SV40NLS com elevada carga positiva fundidas com GFP (3xSV40NLS), resultam na interação desta proteína com cromatina mitótica, enquanto o GFP (sem NLS) fica excluído da proximidade dos cromossomas. Adicionalmente, um mutante de SV40NLS, sem a função canónica do seu NLS, mas ainda altamente carregado (3xSV40NLS KA), encontra-se excluído do núcleo em interfase, permanecendo, no entanto, altamente enriquecido na cromatina mitótica. Estes resultados sugerem que a contribuição do NLS para a interação de fatores de transcrição com a cromatina mitótica resulta da sua capacidade de mediar interações eletrostáticas, e não devido a um mecanismo dependente da maquinaria de importação da célula. A entrada da célula em mitose é acompanhada por uma hiperfosforilação da maquinaria de transcrição, resultando na degradação ou inativação de fatores de transcrição. Resultados anteriores do nosso laboratório mostraram que um Ascl1 não fosforilável (i.e., mutação serina para alanina em locais consensus de fosforilação serina-prolina, fora do seu DNA-binding domain (DBD) (Ascl1-6SA), e o seu DBD sozinho, continuam excluídos da cromatina mitótica. Dado que as fusões GFP de Ascl1-6SA e (Ascl1) DBD podem não possuir o potencial eletrostático necessário para interagir com a cromatina mitótica, uma série de derivados de Ascl1 foram fundidos com a sequência 3xSV40NLS, com o objetivo de revelar potenciais efeitos de modificações pós-traducionais na exclusão do Ascl1 da cromatina em mitose. Com a adição do (3xSV40) NLS, ambas as proteínas Ascl1-6SA-NLS e DBD-NLS mostraram estar enriquecidas na cromatina mitótica, e significativamente mais enriquecidas que o Ascl1wt-NLS. Estes resultados sugerem que a fosforilação dos resíduos serina-prolina, localizados fora do DBD do Ascl1, podem influenciar a capacidade de interação deste fator com a cromatina mitótica. Em conclusão, os resultados obtidos vieram demonstrar que o Ascl1, apesar de possuir atividade pioneira, não tem a capacidade de actuar como um “bookmarker” em mitose. Adicionalmente, mostrei que o sistema TC-ReAsH pode servir como uma boa alternativa a fusões com GFP para estudar a localização sub-celular de fatores de transcrição no contexto de bookmarking mitótico. Estes resultados também sugerem que a contribuição do NLS para o enriquecimento de um fator com a cromatina mitótica condensada resulta de interações eletrostáticas e não da maquinaria de importação. Estudos adicionais serão importantes para mais precisamente identificar as propriedades que fazem com que certos fatores de transcrição tenham a capacidade de interagir com a cromatina condensada durante a mitose. Seria importante também verificar as nossas observações em relação ao Ascl1 num context in vivo, e no contexto de divisões proliferativas e neurogénicas.Castro, DiogoHenrique, DomingosRepositório da Universidade de LisboaSoares, Diogo da Fonseca Lourenço Sampaio, 1991-2021-04-22T00:30:28Z2019-04-222019-04-22T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/39446TID:202229017enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:38:15Zoai:repositorio.ul.pt:10451/39446Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:53:20.982720Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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