The role of notch signaling in thymic and para thyroid glands organogenesis
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| Data de Publicação: | 2013 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/10084 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 |
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The role of notch signaling in thymic and para thyroid glands organogenesisSinalização NotchOrganogéneseTimoGlândulas paratiróidesTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013O timo é um órgão essencial do sistema imunitário, cuja função é gerar linfócitos T auto-restritos e auto-tolerantes que entram em circulação, onde actuam como parte da resposta imune adaptativa. Histologicamente, o timo encontra-se dividido em duas regiões - o córtex e a medula - que se caracterizam pela presença de diferentes Células Epiteliais Tímicas (CETs): corticais (cCETs) ou medulares (mCETs), respectivamente. A função do timo na diferenciação e maturação de linfócitos T é indissociável da função especializada destes dois tipos celulares, assim como da própria arquitectura do órgão. Anatomicamente próximas do timo mas com uma função absolutamente distinta, as glândulas paratiróides são responsáveis pela regulação da homeostase do cálcio extracelular. Quando os seus receptores detectam alterações nos níveis de cálcio no sangue, as células epiteliais sintetizam e secretam a hormona paratiróide que actua em diferentes alvos de forma a permitir o restabelecimento homeostático. Apesar das diferenças funcionais e estruturais, o desenvolvimento destes dois órgãos está intimamente ligado, uma vez que os seus epitélios partilham a mesma origem embrionária – a endoderme da 3ª e 4ª bolsas faríngicas (3/4 BF, em galinha). Os rudimentos do timo e das glândulas paratiróides encontram-se assim identificados pela expressão regionalizada dos marcadores moleculares Foxn1 (Forkhead box N1) e Gcm2 (Glial cells missing-2) na endoderme da 3/4 BF, respectivamente. A origem endodérmica das CETs, assim como a importância das interacções epitélio-mesenquimais na sua especificação, foram primariamente evidenciadas por Le Douarin e Jotereau, utilizando o modelo de quimeras galinha-codorniz. A capacidade de distintos mesênquimas ectópicos suportarem (mesênquima permissivo da somatopleura) ou não (mesênquima não permissivo do botão do membro) o desenvolvimento da endoderme da 3/4 BF na formação de um timo funcional, revela a importância destas interacções na especificação das CETs. Para além disso, um estudo recente identificou dois factores de transcrição, Bmp4 e Fgf10, cuja expressão sequencial na endoderme e no mesênquima é fundamental para especificação da endoderme da 3/4 BF nos epitélios do timo e das glândulas paratiróides. A sinalização Notch é uma via de sinalização celular que regula aspectos como a proliferação, destino, sobrevivência e diferenciação celular no desenvolvimento embrionário e no adulto. A sua importância no normal funcionamento do sistema imunitário, nomeadamente na hematopoiese e linfopoiese, é bem conhecida. De facto, foi demonstrado que a geração das primeiras células estaminais hematopoiéticas assim como a especificação dos progenitores hematopoiéticos nas diferentes linhagens linfoides são acontecimentos dependentes da sinalização Notch. Adicionalmente, a expressão de genes ligados à sinalização Notch em diferentes territórios do timo adulto e a observação do seu envolvimento na diferenciação de linfócitos mas também na diferenciação dos dois tipos de CETs, sugere o envolvimento desta sinalização na organogénese tardia do timo. Existem, no entanto, poucas evidências da sua função nos estadios iniciais da organogénese do timo. Recentemente, o nosso grupo de investigação observou a expressão de genes envolvidos na sinalização Notch, nomeadamente ligandos, receptores e genes-alvo, nos territórios presuntivos do timo e das glândulas paratiróides. Adicionando a conhecida importância desta sinalização no desenvolvimento e função do timo adulto, estas evidências apontam para um papel relevante da sinalização Notch também na fase inicial do desenvolvimento destes dois órgãos. Neste projecto pretendeu-se estudar o papel da sinalização Notch durante os estadios iniciais de desenvolvimento do timo e das glândulas paratiróides, utilizando para isso os modelos de galinha e codorniz. De forma a manipular a sinalização Notch nos territórios presuntivos do timo e das paratiróides foram desenvolvidos dois sistemas organotípicos in vitro: explantes da região faríngica de embriões de codorniz com 3 dias de desenvolvimento; e associações heteroespecíficas da endoderme da 3/4 BF com mesênquima ectópico permissivo da somatopleura (previamente desenvolvido no laboratório, Neves et al, 2012). No primeiro sistema, a estrutura tridimensional da região faríngica é mantida intacta, preservando o contacto da endoderme da 3/4 BF com os tecidos envolventes (mesênquima e ectoderme). Para testar o efeito da inibição farmacológica da sinalização Notch nos estadios iniciais de desenvolvimento do timo e das glândulas paratiróides, os explantes da região faríngica foram mantidos em contacto com dois tipos de inibidores da γ-secretase (cuja função é necessária para a normal sinalização): DAPT e LY411575. A capacidade de inibição da sinalização Notch e o seu efeito na formação do timo e das glândulas paratiróides foram avaliados pela expressão de Hes5.1, Foxn1 e Gcm2, respectivamente, por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Os nossos dados indicam que a inibição da sinalização Notch tende a diminuir a expressão de Foxn1 e Gcm2, sugerindo que o desenvolvimento dos dois órgãos se encontra comprometido na ausência de sinais Notch. O segundo sistema consiste na associação heteroespecífica de endoderme da 3/4 BF de codorniz com mesênquima permissivo da somatopleura de galinha. Esta abordagem permite a manipulação da sinalização Notch especificamente nos territórios presuntivos do timo e das glândulas paratiróides e sua posterior associação a um mesênquima ectópico, necessário para o seu desenvolvimento. Para validar o sistema anterior de inibição da sinalização Notch nos explantes da região faríngica, esta associação de tecidos foi igualmente sujeita a inibição farmacológica da sinalização Notch, como descrito anteriormente. Uma vez mais, os resultados indicam que a ausência de sinais Notch compromete a normal organogénese do timo e das glândulas paratiróides. Para modificar a sinalização Notch de forma estável e a nível celular na endoderme da 3/4 BF, foi usado um sistema de vectores que combina a “transferência génica mediada por Tol2” e a “expressão condicional dependente de tetraciclina”. Assim, a endoderme da 3/4 BF foi geneticamente modificada de forma a promover um ganho ou perda de função da sinalização Notch. Para ganho de função, a endoderme da 3/4 BF foi electroporada com um conjunto de vectores que induzem a expressão da forma intracelular do receptor Notch1 (ICN1), que se sabe activar a sinalização Notch de forma constitutiva e independente da ligação a um ligando. Para perda de função, o mesmo sistema foi utilizado, mas forçando a expressão de uma forma dominante-negativa do co-activador Mastermind-like1 (DNMAML1). Neste contexto, foi construído neste trabalho um novo vector para perda de função com o objectivo de aumentar a estabilidade da proteína DNMAML1 (que tem apenas 205 pares de bases) e de a direcionar para o núcleo por adição de uma sequência com um sinal de localização nuclear, aumentando a sua eficiência. Estas abordagens permitiram testar o efeito da modulação do sinal Notch durante as interacções epitélio-mesenquimais necessárias para a formação dos dois órgãos em estudo, pela avaliação dos níveis de expressão de Foxn1 e Gcm2. Inesperadamente, os resultados de perda e ganho de função mostram uma tendência de fenótipo semelhante, com a descida da expressão de Foxn1 e o aumento da expressão de Gcm2, em ambos os casos. Estes dados demonstram que a perda de função da sinalização Notch especificamente no domínio presuntivo do timo e das glândulas paratiróides tem um efeito diferente do obtido quando toda a região faríngica é sujeita a inibição. Ficam no entanto por aferir as condições deste sistema para ganho de função da sinalização Notch. The thymus is the organ responsible for the differentiation and maturation of Lymphoid Progenitor Cells into T lymphocytes, while the parathyroid glands have a key role in the regulation of the extracellular calcium homeostasis by the production of the parathyroid hormone. Despite their functional differences, the epithelia of these organs derive from the endoderm of the 3rd and 4th pharyngeal pouches (3/4 PP), in avian. Notch signaling has been implicated in several aspects of organogenesis, inclusively having a function during the late stages of thymus development. A recent observation from our group showed Notch-related genes expression in the 3/4 PP endoderm and surrounding mesenchyme suggesting a role for Notch signaling in the thymic and parathyroid glands early-organogenesis. In this study, we investigated Notch signaling effects in avian thymus and parathyroid glands early-organogenesis. For that, we modulated Notch signals in their prospective territories, prior to organ formation. In a first assay, explants of the pharyngeal region of E3 quail embryos were grown in the presence of Notch signaling inhibitors (DAPT or LY411575). After 48h of culture, the expression Hes5.1 (Notch-target gene), Foxn1 (marker for thymus epithelium) and Gcm2 (marker for parathyroid glands epithelium) was evaluated by qRT-PCR. The results showed that the pharmacological inhibition of Notch signaling promoted a decrease of Foxn1 and Gcm2 expression, suggesting that blocking Notch signaling impairs normal early stages of thymus and parathyroid glands development. Moreover, studies were performed to modulate Notch signaling (gain- and loss-of-function) specifically in the prospective territories of the thymus and parathyroid glands (3/4 PP). In this context, I developed a new loss-of-function construct (pT2K-NLS-Cherry-DNMAML1-eGFP). Both in gain- or loss-of-function experiments, the expression of Foxn1 was down-regulated and the expression of Gcm2 was up-regulated. This conflicting data will be subject to further study.The thymus is the organ responsible for the differentiation and maturation of Lymphoid Progenitor Cells into T lymphocytes, while the parathyroid glands have a key role in the regulation of the extracellular calcium homeostasis by the production of the parathyroid hormone. Despite their functional differences, the epithelia of these organs derive from the endoderm of the 3rd and 4th pharyngeal pouches (3/4 PP), in avian. Notch signaling has been implicated in several aspects of organogenesis, inclusively having a function during the late stages of thymus development. A recent observation from our group showed Notch-related genes expression in the 3/4 PP endoderm and surrounding mesenchyme suggesting a role for Notch signaling in the thymic and parathyroid glands early-organogenesis. In this study, we investigated Notch signaling effects in avian thymus and parathyroid glands early-organogenesis. For that, we modulated Notch signals in their prospective territories, prior to organ formation. In a first assay, explants of the pharyngeal region of E3 quail embryos were grown in the presence of Notch signaling inhibitors (DAPT or LY411575). After 48h of culture, the expression Hes5.1 (Notch-target gene), Foxn1 (marker for thymus epithelium) and Gcm2 (marker for parathyroid glands epithelium) was evaluated by qRT-PCR. The results showed that the pharmacological inhibition of Notch signaling promoted a decrease of Foxn1 and Gcm2 expression, suggesting that blocking Notch signaling impairs normal early stages of thymus and parathyroid glands development. Moreover, studies were performed to modulate Notch signaling (gain- and loss-of-function) specifically in the prospective territories of the thymus and parathyroid glands (3/4 PP). In this context, I developed a new loss-of-function construct (pT2K-NLS-Cherry-DNMAML1-eGFP). Both in gain- or loss-of-function experiments, the expression of Foxn1 was down-regulated and the expression of Gcm2 was up-regulated. This conflicting data will be subject to further study.Neves, Hélia Cristina de Oliveira, 1972-Zilhão, Rita, 1959-Repositório da Universidade de LisboaSilva, Joana Clara, 1990-2014-01-15T15:46:21Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/10084TID:201329670enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:55:05Zoai:repositorio.ul.pt:10451/10084Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:34:07.446757Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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