Developmental characterization of neuronal subpopulations involved in zebrafish visual processing

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Esteves, Bernardo Miguel Nunes de Madeira
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/32016
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências,em 2017
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spelling Developmental characterization of neuronal subpopulations involved in zebrafish visual processingDesenvolvimentoNeurociênciasProcessamento visualPeixe zebraLinhas transgénicasTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências,em 2017O sistema nervoso é composto por diversos tipos de células neuronais e gliais organizadas de forma específica de modo a executarem corretamente funções imprescindíveis para o controlo de comportamentos básicos à sobrevivência e respostas comportamentais a estímulos internos e externos. Para tal, é necessária a aquisição de identidades celulares específicas que determinarão diversas características dos circuitos neuronais como: padrões de conectividade e produção de neurotransmissores e recetores, etc. Múltiplos processos imprescindíveis para um desenvolvimento morfológico e funcional adequado estão altamente cronometrados no espaço e no tempo: indução neural, regionalização, neurogénese, migração e diferenciação neural, axonogénese, sinaptogénese e remodelação sináptica. Os processos moleculares e celulares envolvidos no desenvolvimento encontram-se altamente conservados dentro dos vertebrados, desde os anfíbios e peixes até às aves e aos mamíferos. Em particular, o peixe zebra tem desde os anos 80 revelado ser um modelo ideal para estudos de desenvolvimento embrionário e pós-natal, particularmente no desenvolvimento visual. O seu rápido desenvolvimento, transparência e morfologia canónica dos vertebrados que apresenta desde cedo no desenvolvimento são, aliados às novas ferramentas genéticas disponíveis, grandes vantagens deste modelo animal. No início do desenvolvimento embrionário, durante a gastrulação (5-10 horas pós-fertilização, hpf), três folhetos embrionários são gerados: endoderme, mesoderme e ectoderme. Na ectoderme, o tecido neural é induzido pela influência de um grupo de células conhecido com o organizador. As células da futura placa neural convergem para a linha média e expandem-se ao longo do eixo rostro-caudal, através de movimentos de extensão convergente. Seguidamente, ocorre a neurulação onde a placa neural sofre rearranjos e cavita para formar o tubo neural. Desde cedo no desenvolvimento que a regionalização é importante no controlo da diferenciação e aquisição de identidades neuronais, num processo gradual. Esta regionalização é guiada por gradientes de factores parácrinos que ativam vias de sinalização que influenciam a expressão de factores de transcrições específicos. Rapidamente depois da formação do tubo neural formam-se diversas constrições dividindo a sua parte anterior (futuro encéfalo) em diferentes segmentos: prosencéfalo (o mais rostral), mesencéfalo e rombencéfalo (o mais caudal). Esta regionalização serve de base para a produção do primeiro scaffold neural num processo intitulado de neurogénese primária. Os primeiros clusters neuronais são neurónios recém-formados derivados a partir dos clusters de progenitores neurais, que estendem os seus axónios longitudinal e transversalmente ligando-se entre si. No 1º dia após fertilização (dpf) destacam-se: os clusters dorso-rostral e ventro-rostral (prosencéfalo), o cluster ventro-caudal (mesencéfalo) e os mais dorsais cluster epífiseal e núcleo da comissura posterior. Numa região mais caudal, neurónios reticulo espinais estendem axónios para a espinal medula, cujos corpos celulares se localizam no mesencéfalo basal ou no centro de cada rombómero (rombencéfalo). Antes do 2º dpf, a neurogénese secundária ocorre através do crescimento do número de neurónios tendo como suporte o scaffold primário anteriormente formado, reforçando as regiões anatómicas anteriormente visíveis. Neste estádio, o sistema nervoso central anterior apresenta uma organização anatómica canónica dos vertebrados, estando dividido em: prosencéfalo, (telencéfalo e diencéfalo), mesencéfalo (tecto óptico e tegmento) e rombencéfalo (cerebelo e medula oblongata). Nos primeiros dias de desenvolvimento do peixe zebra, a visão é crucial para a sua sobrevivência, tendo um papel fulcral na alimentação, locomoção e reconhecimento do meio e também na modelação e rearranjos nos circuitos neuronais. Na primeira semana, a larva é capaz de executar variados comportamentos como nadar em três dimensões, diversas manobras de fuga, predação e captura de presas, dormir e até aprender. Estes comportamentos estereotipados são baseados em estímulos visuais que são processados pela retina e enviados através de 10 retinal arborization fields para o resto do sistema nervoso central onde a informação será processada e integrada originando um output para uma resposta motora apropriada. Destes comportamentos que se iniciam no 3º dpf, quando as células ganglionares da retina alcançam e enervam os seus alvos, distinguem-se a resposta optomotora (OMR) e optocinética (OKR). Face à movimentação de todo o ambiente, ou campo visual, o peixe responde movimentando-se no sentido contrário de modo a estabilizar a sua posição na água corrente, o qual é chamado de OMR. Por outro lado, face a um estímulo rotacional contínuo o peixe ajusta a direcção dos olhos, alternando entre movimentos oculares lentos e saccades mais rápidas, o qual é chamado de OKR. Nos últimos cinco anos foram propostos modelos para o funcionamento dos circuitos adjacentes, tendo sido identificados a área pretectal e o núcleo do fascículo medio-longitudinal (nMlf) como zonas envolvidas no processamento e integração de sinais nervosos. Através de manipulação genética e com o avanço nas técnicas de imagiologia é agora possível ter uma perspectiva mais geral da formação de circuitos neurais. Contudo, apesar da sua vasta utilização como modelo para o estudo do desenvolvimento do sistema visual ainda existe uma grande necessidade de informação básica relativamente ao desenvolvimento dos circuitos neuronais durante os primeiros estádios do desenvolvimento. A identificação de populações neuronais e o seu papel em circuitos específicos, como no processamento visual, mantém-se crucial para aumentar o conhecimento acerca do desenvolvimento anatómico e funcional do sistema nervoso central no peixe zebra. Uma metodologia para a identificação de populações neuronais é o uso de linhas transgénicas repórteres originadas para expressar GFP (green fluorescente protein) em populações e subpopulações específicas. Estas linhas podem conter um gene repórter (p. ex. GFP) diretamente controlado por sequências regulatórias de genes de interesse ou ter variantes de Gal4 (GFF) inseridas que em combinação com uma linha repórter UAS conduzirão à expressão de GFP nos locais apropriados. Diversos projetos de larga escala têm permitido a geração de centenas de linhas transgénicas, já caracterizadas a nível celular, possibilitando o acesso a 70% do encéfalo larval do peixe zebra e a identificação de subpopulações dentro das diferentes subdivisões anatómicas. O mapeamento de subpopulações é tradicionalmente feito com a deteção múltipla de tipos celulares específicos utilizados como referência espacial anatómica (por ex. TH que marca o sistema catecholaminérgico), o que tem diversas limitações. A destacar, o atlas “Atlas of Early Zebrafish Brain Development” é a obra de referência do desenvolvimento neuronal embrionário e larval do peixe zebra, que intercala dados de expressão génica com encéfalos de referência anatómica, no 2º, 3º e 5º dpf. Grandes esforços têm sido feitos para a compreensão anatómica do sistema nervoso central deste modelo animal através de whole-brain imaging de diversas linhas transgénicas e registo das imagens 3D numa mesma referência. Dois atlas 3D para o 6º dpf, Z-brain e ZBB, encontram-se disponíveis e abertos para consulta e também registo de informação 3D, contendo um canal comum com o sinal da expressão de uma proteína pan-neuronal (tERK). Apesar de representarem uma fonte aberta e poderosa de informação para o conhecimento neuroanatómico do peixe zebra, informação relativamente a estádios de desenvolvimento precoce ainda é escassa. Diversas linhas GFP transgénicas têm sido usadas no laboratório de Mike Orger para o estudo do processamento e resposta de certas subpopulações neuronais a estímulos visuais de alteração da intensidade de luz e direcção de movimento. Com o objectivo de analisar a ontogenia de algumas destas subpopulações durante o desenvolvimento, este estudo caracteriza a expressão de GFP de quatro linhas transgénicas, escolhidas pela sua expressão em estruturas anatómicas envolvidas no processamento visual, utilizando embriões e larvas de peixe zebra desde o 1º até ao 6º dpf. Esta caracterização foi feita recorrendo a imuno-histoquímica das amostras fixadas em paraformaldeído das linhas transgénicas pitx2c:GFP, ChAT GFF, Gad1b GFF e Slc18a3b GFF. O anticorpo anti-GFP foi utilizado para detetar a expressão de GFP das linhas transgénicas em conjunto com um marcador pan-neuronal (anti-tERK) ou mais específico (anti-TH), para referência espacial. Stacks foram adquiridos com microscopia confocal gerando diversos exemplares de encéfalos 3D para cada estádio e linha. A análise da expressão de GFP foi feita comparando as amostras com dados 3D relativos ao 6º dpf, Z-brain e ZBB, juntamente com imagens e representações anatómicas de encéfalos disponíveis no Atlas of Early Zebrafish Brain Development e outra bibliografia. Para todos os estádios, de cada linha, foram selecionadas amostras representativas, apresentadas como projecções em z dos stacks originais. A nomenclatura anatómica utilizada foi baseada na obra Atlas of Early Zebrafish Brain Development. De um modo geral, expressão de GFP foi observada nos 6 dias de desenvolvimento em todas as linhas transgénicas utilizadas. Espacialmente, esta expressão revelou-se bem distribuída em todas as subdivisões anatómicas prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo, aumentando com o avançar do desenvolvimento. Expressão de GFP foi observada em regiões comuns às diferentes linhas, como: na área pretectal, tálamo e tubérculo posterior (diencéfalo), tecto óptico e tegmento (mesencéfalo) e medula oblongata (rombencéfalo). Como esperado, expressão de GFP foi observada em pelo menos uma estrutura anatómica envolvida nos circuitos adjacentes a OMR e OKR em cada uma das linhas transgénicas (por ex. área pretectal e nMlf). Em suma, a caracterização da expressão de GFP de linhas transgénicas no desenvolvimento, é uma abordagem viável para a identificação anatómica de regiões de interesse envolvidas no processamento de estímulos visuais. Acreditamos que este estudo contribuiu para o conhecimento dos processos de aquisição de destinos neurais e desenvolvimento inicial dos circuitos neuronais, bem como para o delineamento e interpretação de futuras experiências de manipulação genética em estádios específicos do desenvolvimento.The nervous system is composed of a number and variety of neuronal and glial cells appropriately connected to reliably perform its functions to control basic survival behaviors (i.e.: breathing) and responses to internal and external stimuli. This requires acquisition of specific cell identities that determine properties such as correct connectivity patterns and production of neurotransmitters and receptors. For an appropriate functional and morphological development multiple processes need to occur: neural induction, regionalization, neurogenesis, migration and neuronal differentiation, axogenesis, synaptogenesis and synaptic remodeling. Since the 80s, the zebrafish has been used as a model to analyze the formation of neuronal circuits during embryonic and postnatal development. With the advances in the field of genetics and imaging it is now possible to address the remaining doubts and lack of knowledge regarding the establishment of neuronal circuits. Due to the array of genetic tools available, its rapid development, transparency and canonical vertebrate morphology, zebrafish is the ideal model to study the development of the central nervous system. Although it has been widely used to study the development of the visual apparatus, information about neuronal circuits involved in visual processing in early stages is still lacking in the bibliography. With the aim of studying specific subpopulations of neurons involved in visual processing, in this project we characterized selected and established GFP-expressing reporter lines through development. The characterization was done on the zebrafish developing brain of embryos and larvae from the first day post fertilization (dpf) until the sixth dpf, using immunohistochemistry and image analysis of data acquired by confocal microscopy. Our analysis identified major anatomical structures and tracts expressing GFP through the prosencephalon, mesencephalon and rhombencephalon, by comparing our data with previous bibliography and 3D atlases on anatomical characterization of gene and protein expression. The characterization and analysis of the selected lines allowed us to examine the ontogenesis of the circuits. Furthermore, it provides a reference for the delineation of further studies involving manipulation of defined circuits at the appropriate time during development.Diez del Corral, RuthThorsteinsdottir, Sólveig,1962-Repositório da Universidade de LisboaEsteves, Bernardo Miguel Nunes de Madeira2018-02-27T15:00:37Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/32016TID:201911302enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:25:56Zoai:repositorio.ul.pt:10451/32016Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:47:20.507623Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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