Estudo da interação proteína-ligando em proteases de serina para desenvolvimento de inibidores da Uroquinase

• Autor(a) principal: Silva, Cátia Sofia Narciso da
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/19119
• topic: Cinética enzimática; Cristalografia de Raios-X; Tripsina; Trombina; Uroquinase; Pichia pastoris; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química

As proteases de serina constituem cerca de um terço das proteases e podem ser encontradas em vírus, bactérias e eucariotas. Possuem uma tríade catalítica no centro ativo para a sua atividade, composta pelos resíduos altamente conservados, Ser-195, His-57 e Asp-102. Receberam esta denominação por terem um mecanismo catalítico comum, caracterizado pela existência de um resíduo de serina no centro ativo, essencial para a atividade enzimática. Em humanos, são responsáveis por funções essenciais, tais como a digestão, coagulação do sangue, a fibrinólise, o desenvolvimento, a fertilização, a apoptose e imunidade. Uma família de inibidores que tem sido extensivamente estudada para estas proteases, mais especificamente para a uroquinase, consiste em derivados do ácido borónico. Estes podem ser inibidores muito potentes, dependendo da sua estrutura e normalmente ligam-se covalentemente à serina catalítica através do átomo de boro. Este trabalho estudou a interação de duas enzimas desta família - tripsina bovina e trombina humana com esta família de inibidores. Um dos objetivos foi também sobre-expressar a uroquinase de forma heteróloga em Pichia pastoris, uma enzima da mesma família. Para a avaliação destas interações recorreu-se às técnicas de cristalografia de raios-X, eletroforese em gel de poliacrilamida e cinética enzimática. De acordo com os dados obtidos nos ensaios cinéticos em que se utilizou o substrato BApNA, concluiu-se que a maior parte destes inibidores inibem a tripsina, sendo que aquele que inibe mais fortemente é o composto AB1 e o que inibe menos ou nada é o composto SR8. Pela cristalografia de raios-X apenas foi possível obter dados de difração da tripsina com o composto AB11 e verificou-se que este interatua com o centro ativo da enzima, tendo sido assim possível determinar a estrutura do complexo enzima-inibidor. Os restantes compostos não se ligaram à proteína, mas em dois deles, no JS67 e no SR5 foi possível visualizar alguma densidade eletrónica de difícil interpretação no centro ativo. No que diz respeito à trombina, não foi possível obter resultados tanto por cristalografia de raios-X como por ensaios cinéticos, dado que não se obtiveram cristais da proteína e não se visualizou interação com o composto JS62. Por último, iniciaram-se os testes de sobre-expressão da uroquinase em Pichia Pastoris, não se tendo obtido resultados fiáveis.