Characterization of models of young and mature bacterial biofilms to study the activity and mechanism of action of a designed cyclic analog of gomesin

• Autor(a) principal: LOPES, Joana Azevedo Felice
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/159125
• topic: Microbiologia; Biofilmes bacterianos; Biofilmes MRSA; Resistência antimicrobiana; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

Os biofilmes bacterianos apresentam alta recalcitrância a agentes antimicrobianos devido a vários fatores, incluindo a presença de uma matriz extracelular que dificulta a sua difusão, a reduzida suscetibilidade de bactérias dentro do biofilme e a degradação enzimática. Neste sentido, o tratamento de infeções associadas a biofilmes enfrenta severos problemas ao nível do tratamento, exigindo o uso de doses mais elevadas ou a aplicação de terapias combinadas para obter eficácia, destacando a necessidade urgente de abordagens inovadoras e alternativas aos antimicrobianos convencionais. O desenvolvimento de biofilmes tem sido uma área central de pesquisa na busca por novas terapias, uma vez que a compreensão da estrutura e dos mecanismos de crescimento do biofilme ainda é mal compreendida. Neste estudo, selecionamos uma estirpe de MRSA formadora de biofilme (LUH14616) para realizar uma ampla caracterização in vitro de biofilmes jovens (1 dia) e maduros (5 dias), e posteriormente investigar a atividade e mecanismo de ação de [G1K, K8R]cGm, um análogo cíclico do péptido antimicrobiano gomesina. Resultados obtidos do ensaio de violeta de cristal revelaram uma maior quantidade de biomassa aderida em estágios de maturação posteriores, embora houvesse menos bactérias por unidade de massa. Notavelmente, evidenciado por microscopias confocal e de força atómica, biofilmes jovens exibiram uma estrutura mais espessa e robusta com bactérias revestidas por uma camada espessa de matriz, contrastando com um biofilme mais fino e rarefeito em estágios de maturação posteriores. Para iniciar o estudo da atividade e do mecanismo de ação de [G1K, K8R]cGm contra biofilmes jovens, foram testadas concentrações crescentes do péptido por 4 e 24 h. No ensaio fluorométrico de redução da resazurina, resultados mostraram que [G1K, K8R]cGm conseguiu reduzir a atividade metabólica das bactérias de forma dose-dependente, atingindo um decréscimo máximo de 55% a 50 µM. Por sua vez, estes resultados foram confirmados por confocal, onde biofilmes tratados com 50 µM [G1K, K8R]cGm apresentavam uma percentagem significativamente maior de células bacterianas com membranas comprometidas, revelando a capacidade do péptido em difundir através da espessa camada de exopolissacárido e permeabilizar a membrana citoplasmática, causando a sua disrupção e, por fim, levando à morte celular. No entanto, uma predominância de bactérias com membrana intacta nas camadas mais profundas foi observada, mostrando um mecanismo dependente da profundidade do biofilme. Estudos de AFM revelaram alterações significativas na morfologia e topografia da superfície dos biofilmes tratados com [G1K, K8R]cGm, indicando um aumento na rugosidade da superfície do biofilme e das bactérias, mostrando uma relação com a capacidade de [G1K,K8R]cGm na disrupção da membrana da célula bacteriana. Em geral, os nossos resultados reforçam a importância de aprofundar o conhecimento sobre a fisiologia dos biofilmes e a sua estrutura tridimensional em termos de distribuição de células e matriz, uma vez que a heterogeneidade dos biofilmes pode afetar a atividade dos agentes antimicrobianos. São necessárias investigações adicionais para avaliar o potencial de [G1K, K8R]cGm contra biofilmes maduros e a sua aplicação no combate a biofilmes bacterianos em diferentes estágios de maturação.