Determinação da actividade de efluxo de Hoechst 33258 em Escherichia coli

• Autor(a) principal: THERON, Maria João de Resende
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/66373
• topic: Microbiologia médica; Biologia molecular; Efluxo de Hoechst; Escherichia coli; Bactérias; Bombas de efluxo; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

Para a detecção da actividade de efluxo em bactérias são normalmente usadas moléculas fluorescentes, que são substratos de bombas de efluxo e cuja concentração intracelular pode ser facilmente detectada por fluorescência. O brometo de etídio é o fluoróforo e substrato de efluxo de eleição para a caracterização da actividade de efluxo em bactérias e serviu de base para o desenvolvimento e optimização do método fluorométrico semiautomático na Unidade de Microbiologia Médica, IHMT/NOVA, para utilização no fluorimetro e termociclador em tempo-real Rotor-Gene 3000. Neste trabalho, adaptamos o método fluorométrico semiautomático em placa de 96 poços para o uso com o fluoróforo Hoechst 33258, um corante menos tóxico que o brometo de etídio, de modo a avaliar a sua eventual aplicabilidade para a caracterização da actividade de efluxo em bactérias, usando duas estirpes de referência de E. coli que diferem entre si na actividade do seu principal sistema de efluxo, o AcrAB-TolC: a estirpe AG100, com o sistema de efluxo AcrAB-TolC funcional e a estirpe AG100A, com o sistema AcrAB-TolC inactivo. Concomitantemente foi avaliado o efeito sinérgico de compostos inibidores de efluxo na resistência intrínseca aos antibióticos, biocidas e corantes nestas duas estirpes. Os resultados obtidos demostram que (i) o Hoechst 33258 é um substrato da bomba de efluxo AcrAB-TolC; (ii) que a tioridazina e a clorpromazina potenciam a acumulação de Hoechst 33258 a níveis similares ao das células cuja a actividade de efluxo foi inactivada; (iii) é possível diferenciar estirpes de E. coli com diferentes níveis de acumulação de Hoechst 33258, nomeadamente, a estirpe AG100 com o sistema de efluxo AcrAB activo e funcional, da estirpe isogénica AG100A, que apresenta o sistema de efluxo AcrAB-TolC inactivado; (iv) o Hoechst 33258 pode ser usado para avaliar a actividade de efluxo em E. coli; (v) o Hoechst 33258 pode ser considerado uma alternativa ao brometo de etídio e (vi) o método fluorométrico semiautomático em placa de 96 poços usando fluorimetro Synergy HT pode ser usado para detectar do transporte de Hoechst 33258 em E. coli. A aplicação do método a novas moléculas fluorescentes permitirá aprofundar o conhecimento sobre a actividade dos sistemas de efluxo bem como identificar novos substratos e novos inibidores numa diversidade de bactérias.