Desenvolvimento de um teste de diagnóstico serológico rápido para a deteção de Pneumocystis jirovecii em amostras clínicas

• Autor(a) principal: Coutinho, Mariana de Carvalho Ribeiro
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/50528
• topic: Antigénio recombinante sintético multiepítopo; Bionanoconjugados; Nanopartículas de ouro; Pneumocystis jirovecii; Pneumonia por Pneumocystis; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias

Pneumocystis jirovecii (P. jirovecii) é um fungo atípico que exibe tropismo para os pulmões, com especificidade restrita para o homem, que causa pneumonia por Pneumocystis (PPc) em doentes imunocomprometidos. O diagnóstico da PPc baseia-se em técnicas de coloração citoquímica, imunofluorescência indireta com anticorpos monoclonais e reação em cadeia de polimerase, com recurso a amostras respiratórias obtidas por métodos invasivos. Por este motivo, surge a necessidade de desenvolver um teste de diagnóstico rápido (TDR) para infeção por P. jirovecii, com recurso a métodos menos onerosos e a amostras biológicas obtidas de forma menos invasiva, como o sangue. Devido às propriedades óticas notáveis das nanopartículas de ouro (AuNP), o presente estudo teve por objectivo conjugar AuNP esféricas com o antigénio recombinante sintético multiepítopo (antigénio rsm), específico de P. jirovecii, para a formação de bionanoconjugados AuNP-Antigénio, com vista ao desenvolvimento do TDR. Com o intuito de obter maior quantidade de antigénio, foi necessário isolar o vetor de expressão pLATE31, que continha a sequência codificante para o antigénio rsm, expresso em E. coli BL21 Star (DE3) e clonar em E. coli XJb (DE3). Por cromatografia de afinidade de ião metálico obtiveram-se melhores resultados na purificação com o ião cobre comparativamente aos iões zinco, cobalto e níquel. Por eletroforese em gel de agarose a 0,3% verificou-se que o ligando MUA permitiu formar bionanoconjugados mais estáveis e robustos, sendo que para a razão molar [Antigénio]/[AuNP-MUA] 1:500 foi possível garantir a existência de uma camada de antigénio a revestir a superfície das AuNP. Este resultado foi igualmente comprovado pela variação da força iónica e do pH do meio envolvente, uma vez que os bionanoconjugados apresentaram um comportamento distinto das AuNP funcionalizas com diferentes ligandos. Com esta abordagem foi possível formar bionanoconjugados AuNP-MUA-Antigénio estáveis e robustos que no futuro permitirão detetar anticorpos anti-P. jirovecii e consequentemente desenvolver o TDR da PPc.