PIWI proteins in mammals: a cow's perspective
| Autor(a) principal: | |
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| Data de Publicação: | 2011 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/4533 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 |
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PIWI proteins in mammals: a cow's perspectiveGenética molecularExpressão génicaMamíferosBovinosTeses de mestrado - 2011Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011The integrity of DNA is under constant threat from both exogenous and endogenous agents. As a response, the cell has evolved numerous mechanisms to protect its genetic information from such dangers, especially in the germline, where unwanted changes in the genome can be transferred to the offspring. One major peril to genomic stability are transposable elements, mobile genetic fragments that can insert themselves at new locations in the genome. The mechanisms involved in controlling these elements are poorly understood. However, recent breakthroughs have provided insight into a germ cell-specific mechanism that silences transposons through RNA interference. Piwi, a subclass of the Argonaute protein family, associates with a novel class of small RNAs termed piRNAs. Interestingly, these piRNAs exhibit sequences complementary to those of transposable elements and, together with Piwi proteins, are able to thwart the mobility of such elements. Although the importance of Piwi proteins in germ cells has been established in many different organisms, in mammals Piwi function seems to be male-specific. Interestingly, phylogenetic examination of the Argonaute protein family revealed an additional Piwi gene (PIWI-LIKE 3 or PIWIL3) that is present in numerous mammals, including humans and bovine, but absent from rodents. Until a thorough analysis of PIWIL3 and other Piwi-like genes is performed in other animals, we cannot exclude a function for these genes in female mammals. Here, we show that PIWIL3 mRNA and protein are expressed in bovine oocytes. Using quantitative PCR we have determined the relative expression pattern of PIWIL3 transcripts during oocyte maturation and early embryo development. Furthermore, immunofluorescence studies localized Piwi-like 3 to the meiotic process of bovine oocytes. Lastly, preliminary experiments were made in an effort to adapt a known transfection mechanism to its use in bovine oocytes.A protecção do conteúdo genético das células é essencial para manter a integridade da informação responsável pela vida. Existem vários factores que podem afectar a estabilidade do genoma, tais como: radiação ultravioleta, compostos mutagénicos e erros de replicação do DNA. Contudo, um dos maiores perigos que a célula enfrenta encontra-se no próprio código genético. Uma grande proporção dos genomas eucarióticos corresponde a sequências repetidas denominadas transposões. Os transposões são elementos genéticos móveis que têm a capacidade de inserir-se em novos locais do genoma, podendo interferir com a estrutura e função de genes essenciais para a célula. O perigo iminente da transposição genética merece especial atenção em células da linha germinal, onde qualquer alteração no genoma pode ser transferida à descendência. Por esta razão, torna-se necessário controlar a mobilidade destes elementos. RNA interferência (RNAi) é um mecanismo de regulação da expressão génica que tem sido implicado no silenciamento de elementos móveis. Esta ferramenta celular utiliza uma proteína da família Argonaute associada a uma sequência de RNA de pequenas dimensões como motor de pesquisa, localizando sequências mensageiras de RNA (mRNA) que lhe sejam complementares. Uma vez encontradas, esses mRNAs são clivados pelo complexo proteico (proteína Argonaute) acoplado ao RNA guia, impedindo a sua tradução. A família de proteínas Argonaute pode ser dividida em dois grupos: o grupo Ago, que são expressas ubiquitamente; e o grupo Piwi, cuja expressão é restrita às células da linha germinal. Para além do seu padrão de expressão, estes grupos de proteínas também diferem na classe de RNAs aos quais se associam. Membros do grupo Ago interagem com miRNAs e siRNAs, enquanto que proteínas Piwi interagem com uma nova classe de RNAs, denominados piRNAs (piwi-interacting RNAs). O estudo de proteínas Piwi e piRNAs tem avançado consideravelmente nos últimos anos com base em experiências realizadas em Drosophila, C. Elegans, zebrafish e ratinho. Estas experiências têm convergido para um papel das proteínas Piwi no desenvolvimento e sobrevivência das células da linha germinal. No genoma do ratinho existem três genes da família Piwi: miwi (Piwi-like 1), mili (Piwi-like 2) e miwi2 (Piwi-like 4). A produção de indivíduos mutantes para qualquer uma destas proteínas resulta na esterilidade de ratinhos machos, mas em fêmeas nenhum defeito é visível. Contrariamente, noutros animais modelo o conhecimento sobre a biologia das proteínas Piwi surgiu do estudo das células germinais de ambos os sexos. Ainda não foi possível identificar um papel para estas proteínas na linha germinal feminina de mamíferos. O avanço no conhecimento das proteínas Piwi deve-se principalmente à identificação e sequenciação dos pequenos RNAs a que se associam, os piRNAs. A sua análise genómica revelou que estas sequências correspondem a áreas teloméricas e centroméricas dos cromossomas, que são maioritariamente populadas por elementos repetitivos e cópias de transposões e, por esta razão, foram denominadas de clusters de piRNA. Estes clusters podem ser transcritos e produzir piRNAs de ambas as cadeias genómicas, que são subsequentemente acoplados a uma proteína Piwi. Os complexos Piwi-piRNA formados podem agora procurar sequências complementares de transposões e provocar a sua degradação, protegendo assim a integridade do genoma. Esta descoberta revelou uma nova função para zonas genómicas que até agora eram consideradas “lixo genético”. Assim, estas sequências funcionam como um sistema imunitário genético, impedindo que elementos móveis como os transposões provoquem alterações na informação que será transmitida à descendência. Considerando o estado de conservação das proteínas Piwi e o seu largo espectro de acção, parece improvável que a sua função seja dispensável em ovários de mamíferos. Recentemente foi identificado um quarto gene Piwi-like (PIWIL3) em muitos mamíferos (incluindo humanos e bovinos) que se encontra ausente do genoma do ratinho, razão pela qual ainda não foi estudado. Adicionalmente, o perfil de pequenos RNAs em oócitos de bovino revelou a existência de uma população acentuada de piRNAs, situação que não se observa em ratinho. Estas observações indicam que até este e os outros genes da família Piwi não forem examinados em outros animais, não se pode excluir por completo a sua participação no desenvolvimento da linha germinal feminina. Por esta razão, este projecto foi desenvolvido utilizando a vaca como organismo modelo. Apesar das limitações óbvias de manipulação, a investigação em bovino tem algumas vantagens. Grandes quantidades de ovários podem ser obtidos como material descartado de matadouros locais, a partir dos quais óvulos saudáveis podem ser extraídos. Adicionalmente, estes óvulos podem ser maturados in vitro, fertilizados, e podem manter-se em cultura até ao momento de implantação, isto é, até a fase de blastocisto. Neste trabalho demonstramos que a proteína Piwi-like 3 é expressa em oócitos de bovino, ao contrário da situação observada em ratinho. Em primeiro lugar, determinámos através de RT-PCR que a expressão de PIWIL3 encontra-se restrita aos tecidos germinais de bovino, sendo apenas detectável significativamente em ovários e testículos. De seguida verificou-se a presença de mRNA de PIWIL3 dentro desse contexto, focando a nossa atenção nos ovários. Para isso, foram recolhidas amostras em diferentes pontos do desenvolvimento de oócitos e embriões: vesícula germinal, metafase I, metafase II, zigoto, 2 células, 4 células, 8 células, morula e blastocisto. Utilizando novamente PCR, observamos que PIWIL3 encontra-se presente ao longo de todo o processo de maturação e durante o desenvolvimento embrionário pré-implantação. Para obter uma descrição mais detalhada da expressão deste gene, foi utilizada a técnica de PCR quantitativo, que permite detectar se o gene em estudo se encontra sob regulação. Os nossos resultados não mostraram nenhuma alteração significativa na expressão de PIWIL3 nos pontos temporais testados. Foi apenas detectado um ligeiro aumento de expressão no momento da metafase II, o que sugere um papel para esta proteína durante o processo de maturação. Contudo, a presença de mRNA não implica a existência de proteína nesta altura e, por esta razão, realizaram-se experiências de imunocitoquímica para comprovar a presença e localização da proteína. Em contraste com o padrão observado para mRNA, a proteína Piwi-like 3 foi detectada numa janela temporal menos abrangente, estando apenas presente durante a maturação do oócito até à formação dos pronúcleos. Neste contexto, verificou-se que Piwi-like 3 localiza-se junto dos cromossomas durante o evento da meiose, acompanhando todos os movimentos provocados pelo fuso meiótico. Por fim, com o objectivo de levar a cabo estudos funcionais, foi testada a possibilidade de introduzir RNA fluorescente em oócitos de bovino. Se possível, no futuro poderá introduzir-se RNAs de dupla cadeia que utilizem a maquinaria de RNAi para diminuir os níveis de PIWIL3 em oócitos, simulando uma célula mutante. Os nossos resultados mostram que é possível introduzir RNAs em oócitos sem consequências graves para a célula, abrindo a porta para estudos funcionais em oócitos de bovino. Os nossos resultados apontam para uma possível função para Piwi-like 3 ao longo do processo de maturação, particularmente durante a meiose. Tendo em conta trabalhos relacionados em outros organismos, especulamos também sobre a possibilidade de Piwi-like 3 e piRNAs serem acumulados maternalmente, sobre a participação desta proteína no transporte e localização de mRNA e no silenciamento de transposões. Este trabalho alerta-nos também da importância de conduzir e desenvolver estudos em organismos alternativos, uma vez que a situação observada em animais modelo não representa necessariamente uma classe inteira de animais.Rodrigues, Maria Gabriela, 1965-Roelen, BernardRepositório da Universidade de LisboaSilva, Ricardo Andrés Zacarias, 1988-2011-11-21T18:03:17Z20112011-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/4533enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:45:34Zoai:repositorio.ul.pt:10451/4533Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:30:08.951465Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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