Analogues of the antimicrobial peptide BP214

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Coelho, Catarina Rainho
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/36010
Resumo: Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017
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network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
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spelling Analogues of the antimicrobial peptide BP214Antimicrobial peptidesAntimicrobial activityHemolytic activityHydrophobicityMestrado Integrado - 2017Ciências da SaúdeTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017The excessive and uncontrolled use of antibiotics over the last decades has contributed strongly to the increase in the number of resistant microorganisms and with this, the increase in the number of deaths due to intractable infections and an increase of the Healthcare expenditure. For economic and regulatory reasons, the development of new antibiotics has also decreased significantly. Thus, the search for new therapeutic alternatives to conventional antibiotics led researchers to focus on the study of antimicrobial peptides. In addition to antimicrobial activity, these peptides have the ability to exhibit antibiofilm, immunomodulatory and anticancer activities. Recently a previous study reported BP214 peptide, an analogue of the cecropin-α-melittin hybrid BP100, which showed a high antimicrobial potential against colistin-resistant Acinetobacter baumannii strains and other relevant bacterial agents and a relatively low hemolytic activity. In order to identify the most important amino acids for BP214 activity, a D-Alanine scan was performed. Thus, eleven new analogues of the BP214 peptide were synthesized through the solid-phase peptide synthesis. Subsequently, the synthesized peptides were analysed and purified using MALDI-TOF mass spectrometry and reversed-phase HPLC. Finally, its antimicrobial and hemolytic activities were determined. In the analogues where a single lysine or arginine was replaced by alanine, an improvement in antimicrobial activity against most bacterial strains was verified. On the other hand, with the substitution of a single leucine, isoleucine, phenylalanine or tyrosine, the analogues showed a reduced antimicrobial potential compared to BP214. In addition, all analogues which showed antimicrobial activities as good or better than the BP214 peptide also showed higher hemolytic toxicities. From the information obtained with reversed-phase HPLC, it was still possible to relate the retention time of each peptide to its hydrophobic character. Thus, the influence of the hydrophobicity on antimicrobial and hemolytic activities and consequently on cell selectivity was ascertained. All analogues that showed a superior hydrophobic character to BP214 were also those that showed superior antimicrobial and hemolytic activities. Before presenting the results, a detailed procedure of all the methods performed was also included in this dissertation.O uso excessivo e descontrolado de antibióticos nas últimas décadas tem contribuído fortemente para o aumento do número de microrganismos resistentes e com isto, o aumento do número de mortes por infeções intratáveis e um aumento nas despesas para a saúde. Por questões económicas e regulamentares, o desenvolvimento de novos antibióticos tem também diminuído significativamente. Assim, a procura de novas alternativas terapêuticas aos antibióticos convencionais levou investigadores a focarem-se no estudo dos péptidos antimicrobianos. Os péptidos antimicrobianos são pequenas moléculas anfipáticas e catiónicas com elevada seletividade e especificidade, que existem naturalmente nos seres vivos e que contribuem para a defesa imunitária dos mesmos. Como a superfície das células bacterianas é carregada negativamente, os péptidos antimicrobianos, com carga positiva, são atraídos electrostaticamente, provocando a disrupção da membrana bacteriana e, assim, a morte celular. Atualmente, inúmeros péptidos antimicrobianos já foram identificados e alguns mesmo já se encontram aprovados como fármacos. Para além da atividade antimicrobiana, estes péptidos têm a capacidade de exibir atividades antibiofilme, imunomodulatória e anticancerígena. Contudo, a baixa biodisponibilidade, o curto tempo de semivida, a dificuldade na purificação e a toxicidade hemolítica que apresentam tornam essencial a síntese para a otimização destas estruturas. Recentemente foi reportado o péptido BP214 (kklfkkilryl-NH2), um análogo do híbrido cecropina-α-melitina BP100 (KKLFKKILKYL-NH2), que mostrou um elevado potencial antimicrobiano contra estirpes de Acinetobacter baumannii resistentes à colistina e outros agentes bacterianos relevantes, para além de uma atividade hemolítica relativamente reduzida na presença de altas concentrações de péptido. Com o objetivo de identificar quais os aminoácidos mais importantes para a atividade do BP214, procedeu-se à realização de um scan de D-Alanina, ou seja, à substituição de cada um dos aminoácidos da sequência peptídica do BP214 pelo aminoácido D-Alanina. Assim, através da síntese de péptidos em fase sólida, foi então possível sintetizar onze novos análogos do péptido BP214. A síntese em fase sólida é o método de escolha na síntese de péptidos, em particular a estratégia Fmoc/tBu, a mesma estratégia utilizada no presente estudo. Nesta síntese em fase sólida, um primeiro aminoácido, protegido pelo grupo Fmoc no grupo α-amina, é acoplado através do resíduo C-terminal a um suporte sólido polimérico, a resina. De seguida, a desproteção da amina permite o ataque nucleofílico deste grupo ao ácido carboxílico do segundo aminoácido, com a formação de uma ligação amida. O grupo Fmoc é lábil a bases, por isso é removido através do tratamento com piperidina, uma base forte. Este ciclo repete-se até que todo o péptido desejado seja obtido. Os péptidos sintetizados neste trabalho foram posteriormente analisados e purificados usando o HPLC em fase-reversa, de modo a obter uma purificação de pelo menos 95%. E, de forma a identificar e determinar a massa molecular dos mesmos, foi utilizada a espectrometria de massa MALDI-TOF. Em anexo, são apresentados os respetivos cromatogramas e espectros. Por fim, as suas atividades antimicrobiana e hemolítica foram determinadas. A resistência antimicrobiana está sobretudo associada a bactérias Gram-negativas, por essa razão, a atividade antimicrobiana dos análogos do péptido BP214 foi testada contra estirpes de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae e Acinetobacter baumannii, todas bactérias Gram-negativas clinicamente revelantes. Utilizando a microdiluição em caldo, um dos métodos mais usados para avaliar o potencial antimicrobiano de fármacos, cada uma das bactérias selecionadas foi inoculada com diferentes concentrações dos péptidos em estudo e as suas concentrações mínimas inibitórias foram determinadas. Contudo, não basta apenas que os péptidos antimicrobianos apresentem elevada atividade bactericida para que possam ser aplicados na prática clínica. É também essencial que demonstrem baixa toxicidade contra as células hospedeiras, em particular, os eritrócitos. Para a determinação da atividade hemolítica, diferentes concentrações de péptido foram também incubadas com uma suspensão de glóbulos vermelhos e, a partir da hemoglobina libertada, a percentagem de hemólise foi calculada. Nos análogos em que se procedeu à substituição de uma única lisina ou arginina pelo aminoácido alanina, verificou-se uma melhoria na atividade antimicrobiana contra a maioria das estirpes bacterianas, com concentrações mínimas inibitórias inferiores a 8 µg/mL. Por outro lado, com a substituição de uma única leucina, isoleucina, fenilalanina ou tirosina, os análogos demonstraram uma diminuição no potencial antimicrobiano em relação ao péptido BP214, em particular a substituição da leucina na posição 11, que revelou concentrações mínimas inibitórias superiores a 128 µg/mL na generalidade dos casos. Estes resultados sugerem que os aminoácidos lisina e arginina não são cruciais para a atividade do BP214 e que os aminoácidos leucina, isoleucina, fenilalanina e tirosina são importantes para a atividade deste mesmo péptido. Para além disso, todos os análogos que revelaram concentrações mínimas inibitórias tão boas ou melhores que o péptido BP214, apresentaram também uma toxicidade hemolítica superior. Também se observou que, de todas as estirpes bacterianas selecionadas, as piores concentrações mínimas inibitórias (≥ 34 µg/mL) dos análogos do péptido BP214 foram obtidas para a Pseudomonas aeruginosa. Este resultado já era de esperar, uma vez que a Pseudomonas aeruginosa é um microrganismo que adquire facilmente resistências. A partir da informação obtida no HPLC de fase reversa, foi ainda possível relacionar o tempo de retenção de cada péptido sintetizado com o seu caráter hidrofóbico. Deste modo, averiguou-se a influência da hidrofobicidade nas atividades antimicrobiana e hemolítica e consequentemente, na seletividade celular. Todos os análogos que mostraram um caráter hidrofóbico superior ao péptido BP214, foram também os que revelaram atividades antimicrobianas e hemolíticas superiores. Com isto concluiu-se que a hidrofobicidade contribui para o aumento da atividade antimicrobiana e da toxicidade hemolítica e assim, para a redução da seletividade celular. Assim, apesar de alguns dos análogos do péptido BP214 terem-se revelado bastante promissores quanto ao seu potencial antimicrobiano, também mostraram uma toxicidade significativa que torna pouco provável a continuação dos seus estudos e a sua aplicação futura no tratamento de doenças infeciosas. Antes da apresentação dos resultados foi também incluído, nesta dissertação, um procedimento detalhado de todos os métodos realizados para atingir os objetivos deste trabalho, com base nos protocolos fornecidos e utilizados pelo laboratório.Hansen, Paul RobertLopes, FranciscaRepositório da Universidade de LisboaCoelho, Catarina Rainho2018-12-18T20:36:15Z2017-12-0720172017-12-07T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/36010enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:32:21Zoai:repositorio.ul.pt:10451/36010Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:50:21.711435Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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