Purificação da peroxidase da azeitona negrinha do Douro : identificação e caracterização das principais isoenzimas

• Autor(a) principal: Nunes, Cláudia Sofia Cordeiro
• Data de Publicação: 2002
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/15297
• topic: Química dos alimentos; Azeitonas; Enzimologia

O objectivo deste trabalho foi o isolamento e caracterização da peroxidase da azeitona Negrinha do Douro. A primeira parte deste trabalho consistiu na optimização de um método de extracção e purificação da enzima. Na segunda parte fez-se uma caracterização parcial das diversas isoenzimas purificadas. Neste estudo foram utilizadas azeitonas em dois estados de amadurecimento, identificados pela cor, pretas e verdes. O procedimento de purificação utilizado para isolar as isoperoxidases presentes na polpa da azeitona consistiu na precipitação selectiva com sulfato de amónio, seguida de cromatografia de troca catiónica e cromatografia de troca aniónica. Na polpa de azeitona preta foram detectadas e purificadas oito isoenzimas, sendo quatro catiónicas e quatro aniónicas. Na azeitona verde foram isoladas nove isoperoxidases, sendo quatro catiónicas e cinco aniónicas. A electroforese por SDS -PAGE e a focagem isoeléctrica apresentaram apenas uma banda de proteína para todas as isoenzimas, facto que confirma a sua homogeneidade. As isoenzimas catiónicas da azeitona preta apresentaram pesos moleculares entre 60 e 70 kDa, enquanto que as aniónicas tinham cerca de 20 kDa. Na azeitona verde, três isoenzimas catiónicas apresentaram pesos moleculares de 20 kDa e a restante isoenzima catiónica apresentou um valor idêntico ao determinado para as isoenzimas catiónicas da azeitona preta, cerca de 70 kDa. A análise por SDS-PAGE com ? -mercaptoetanol revelou que cada isoenzima era constituída por uma única cadeia polipeptídica. As isoenzimas aniónicas A1 e A2 da azeitona preta tinham um ponto isoeléctrico de 6,9, enquanto que as A3 e A4 tinham pontos isoeléctricos de 4,4 e 4,6 respectivamente. O efeito do pH e temperatura, as constantes cinéticas (KM e velocidade máxima) para o peróxido de hidrogénio e o fenol e o conteúdo em glúcidos foram analisados para a isoperoxidase A4 da azeitona preta. O pH e a temperatura óptima de actividade de peroxidase foi 7,0 e 35 ºC, respectivamente. A análise de açúcares da isoenzima A4 revelou que a fracção glicosídica representa 28% da massa de enzima, sendo constituída maioritariamente por arabinose (64% mol), contendo também glucose, ramnose e galactose. O extracto enzimático da azeitona preta, obtido por precipitação com sulfato de amónio apresentou uma estabilidade térmica reduzida. Um tratamento de 15 minutos a 35 ºC ou 40 ºC provoca a inactivação completa da peroxidase.