Computational and validation approaches in proteomics discovery of disease biomarkers

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, André
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.18/6864
Resumo: Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2019.
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spelling Computational and validation approaches in proteomics discovery of disease biomarkersSickle Cell DiseaseProteomicsBioinformaticsBiomarkersWestern blotProteómicaAnemia das Células FalciformesBioinformáticaBiomarcadoresWestern blotGenómica FuncionalGenómica Funcional e EstruturalDissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2019.Dissertação orientada por: Doutora Deborah Penque, PhD, Instituto Nacional de Saúde Doutorr Ricardo Jorge; Professora Doutora Deodália Dias, PhD, Universidade de Lisboa.O estudo em larga escala de proteínas, a proteómica, está a mudar amplamente a nossa compreensão das funções dos genes na era pós-genómica. Depois da revolução na genómica pelos métodos de sequenciação de ADN (ácido desoxirribonucleico), a proteómica tem vindo a aumentar o nosso conhecimento sobre a variabilidade, localização, função e vias metabólicas das proteínas na célula, tecido ou organismo. O desenvolvimento de biomarcadores, como uma componente relevante na tomada de decisões, tanto nos processos clínicos quanto no desenvolvimento de novos medicamentos, é uma área emergente onde a proteómica tem vindo a ganhar relevo. As tecnologias proteómicas permitem uma análise comparativa, qualitativa e quantitativa de milhares de proteínas de células/tecidos de doentes versus indivíduos controles, assim como, de doentes antes e depois de um determinado tratamento. As proteínas identificadas diferencialmente abundantes e/ou modificadas pós-traducionalmente na condição de doença ou em resposta a terapia, são possíveis candidatas a biomacardores destas condições. No entanto, a interpretação da enorme quantidade de dados proteómicos, gerados principalmente por experiências baseadas em espectrometria de massa (MS), requer suporte computacional para processamento e análise dos dados de forma efetiva e robusta. A Proteómica computacional estuda os métodos computacionais, algoritmos, bases de dados e metodologias utilizadas para processar, gerir, analisar e interpretar os dados produzidos em experiências proteómicas na identificação de potenciais biomarcadores. O Laboratório de Proteómica do INSA (Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge), através da busca de biomarcadores proteómicos para compreensão de doenças tais como a Anemia das Células Falciformes (ACF), tem produzido grandes dados de MS que necessitam de análise computacional, sendo este o principal propósito deste projeto (ver abaixo objetivo deste estudo). A ACF, também denominada por drepanocitose ou anemia drepanocítica, é um distúrbio monogénico autossómico recessivo, clinicamente heterogéneo, caracterizado por episódios recorrentes de hemólise grave, vaso-oclusão e infecção. Vários modificadores genéticos e ambientais foram sugeridos para modular o início e o curso da ACF. Especificamente, os componentes vasculares da patologia (por exemplo, acidente vascular cerebral) foram submetidos a pesquisas intensivas e o uso de metodologias proteómicas promete oferecer novas percepções moleculares sobre a fisiopatologia da ACF. A mudança do estado estacionário para a crise ainda é em grande parte imprevisível. A fim de descobrir biomarcadores putativos para essa exacerbação, o laboratório do INSA analisou por proteómica de shotgun MS, amostras de plasma e glóbulos vermelhos (GV), de um grupo de pacientes com ACF em estado estacionário e em crise (episódio de vaso-oclusão). Objetivo do estudo: Este estudo teve como objetivo analisar os dados de shotgun MS gerados para a ACF através de plataformas de proteómica computacional de código aberto, nomeadamente o PatternLab e o MaxQuant , no sentido de identificar proteínas como possíveis candidatos a biomarcadores da ACF e em particular da ACF associada a vaso-oclusão. O PatternLab for Proteomics é um ambiente computacional integrado para análise de proteómica shotgun, formatando bancos de dados de sequências, que realizam a correspondência de espectro peptídico, filtrando estatisticamente e organizando dados por proteómica diferencial, exibindo resultados em formato de gráficos, realizando estudos orientados por similaridade com dados de sequenciação de novo, ajudando à compreensão do significado biológico dos dados à luz da Ontologia Genética (Gene Ontology). O MaxQuant é um conjunto de algoritmos, que inclui a detecção de picos e a pontuação de péptidos, realiza a calibração em massa e pesquisas em bancos de dados para identificação de proteínas, quantifica proteínas identificadas e fornece estatísticas resumidas. Para validar os achados proteómicos, algumas das proteínas identificadas diferencialmente na patologia por essas plataformas computacionais, foram selecionadas para validação (verificação) através de abordagens como Western blot. O Western blot é uma técnica bioquímica imunológica na qual uma mistura de proteínas é separada por gel 1DSDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis), transferida para uma membrana, posteriormente incubada com anticorpo específico contra a proteína de interesse. A reação, geralmente visualizada por quimioluminescência, pode ser quantificada por densitometria. De todas as 111 proteínas diferencialmente expressas identificadas (74 da fração citoplasmática e 37 da fração membranar) associadas ao evento de crise na ACF, a peroxiredoxina-2, a catalase, a Hsp70 e Hsp 90 foram validadas por Western blot. Destas 4 proteínas, apenas a peroxiredoxina-2 apresentou significância estatística. Das proteínas diferencialmente expressas que hipoteticamente podem estar associadas à ACF, um promissor biomarcador de crise, nomeadamente, a Voltagedependent anion-selective channel protein 1 (VDAC1) foi encontrada diminuída. Os resultados sugerem que episódios de vaso-oclusão em doentes com ACF podem estar associados à diminuição da VDAC1 nos glóbulos vermelhos. Os resultados deste projeto após apresentação e discussão podem contribuir para um melhor entendimento das vias moleculares associadas à ACF, bem como para a identificação de modulações proteicas específicas, como possíveis candidatos a biomarcadores para essas patologias.The Laboratory of Proteomics at INSA (Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge) by searching biomarkers for Sickle-cell disease (SCD) has been produced considerable Mass Spectrometry (MS) data, needing computational analysis to process, manage, analyze and interpret the data to reveal relevant biomarkers. SCD is a clinically heterogeneous autosomal recessive monogenic disorder characterized by recurrent episodes of severe haemolysis, vaso-occlusion and infection. Several genetic and environmental modifiers have been suggested to modulate the onset and course of SCD. The vascular components of the pathology have been thus subjected to intensive research and the usage of proteomics methodologies promises to offer novel unbiased molecular insights into the pathophysiology of SCD. The objective of this project is to analyze by different bioinformatics tools the MS raw data that have been generated by INSA’s Lab in order to investigate biological/molecular mechanisms responsible for protein changes that might be related with the development of SCD. The most pertinent proteins identified by these computational approaches associated with those pathologies will be selected for further validation as candidate biomarkers by using western blot methods. From all the identified 111 differentially expressed proteins (74 cytoplasmatic fraction and 37 membrane fraction) associated with SCD crisis event, Peroxiredoxin-2, Catalase, 70-kDa Heat shock protein and Heat shock protein 90 were validated with Western blot. From these 4 proteins only Peroxiredoxin-2 showed statically significant. Of the differentially expressed proteins that hypothetically may be associated with SCD, a promise candidate biomarker of crisis namely the Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 (VDAC1) was found decreased. Our results suggest that vaso-occlusion episodes in SCD patients may be associated with decreased VDAC1 in their RBCs. This study indicated that SCD patients at crisis-state are under oxidative stress and the proteins such as PRDX2 and VDAC1 are promising candidates biomarkers for SCD crisis-state. In summary, the main objective of this project is to contribute to a better understanding of the molecular mechanisms associated with these pathologies, as well as to discover new diagnostic, prognostic or monitoring biomarkers for these diseases, leading to the development of new methods that would increase the quality of life of these patients.Penque, DeborahDias, DeodáliaRepositório Científico do Instituto Nacional de SaúdeCosta, André2021-11-30T01:30:12Z20192019-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.18/6864enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-20T15:41:44Zoai:repositorio.insa.pt:10400.18/6864Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T18:41:36.959042Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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