Desenvolvimento de um novo método de quantificação molecular com base em qPCR para estudo da vaginose bacteriana

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pinto, Ana Sofia Gonçalo
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1822/88362
Resumo: Dissertação de mestrado em Biotecnologia
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Os métodos de diagnóstico mais utilizados para a VB são nomeadamente, o método de Amsel (método clínico) e o método de Nugent (método laboratorial), porém, ambos o métodos apresentam limitações. Tendo isto em conta, o objetivo principal deste estudo debruçou-se no desenvolvimento de um potencial novo método molecular para futura aplicação no diagnóstico para VB. Para atingir este objetivo, foi necessário proceder à realização de curvas de calibração para 3 espécies, G.vaginalis, F.vaginae e P.bivia, frequentemente associadas à formação de biofilme em casos positivos para esta condição. Para tal, primeiramente foi adicionado controlo exógeno às suspensões bacterianas, uma suspensão de E.coli, de modo a normalizar as perdas bacterianas que correm durante a extração e proporcionar uma melhor quantificação bacteriana. As curvas de calibração construídas demonstraram uma boa relação entre quantidade bacteriana e quantidade de gDNA extraído, tanto para amostras de suspensões bacterianas como para amostras de suspensões de biofilmes, numa faixa entre as 1×108 células/mL e 1×103 células/mL. A precisão das curvas foi avaliada pela realização de mock cultures, as quais aferiram a inexistência de erros significativos em amostras a altas concentrações (108 células/mL) e a baixas concentrações (103 células/mL). Adicionalmente, os ensaios de desenvolvimento de biofilme com recurso às curvas de calibração, revelaram-se úteis para avaliar a evolução das 3 bactérias ao longo do tempo, relatando-se uma maior constituição de G.vaginalis, seguida por F.vaginae e por fim P.bivia. Em suma, os resultados obtidos demonstraram que a estratégia escolhida para construir curvas de calibração contendo um normalizador externo, podem servir como um bom método de diagnóstico para a VB, sendo necessário realizar estudos futuros, nomeadamente na vertente de testar as curvas para amostras vaginais, uma vez que os estudos in vitro não mimetizam a complexa diversidade da microbiota vaginal in vivo.Bacterial vaginosis (BV) is a common condition among women of reproductive age and is characterized by a decrease in lactic acid-producing bacteria, usually Lactobacillus spp., which consequently led to the growth of obligate or facultative anaerobic bacteria. The most widely used diagnostic methods for BV are the Amsel (clinical method) and the Nugent (laboratory method), but both methods have limitations. The main aim of this study was to develop a potential new molecular method for future application in the diagnosis of BV. For this purpose, it was necessary to develop calibration curves for 3 species, G.vaginalis, F.vaginae and P.bivia, which are frequently associated with biofilm formation in positive cases of this condition. First, an exogenous control, composed of a suspension of E.coli, was added to the target bacterial suspensions, in order to normalize the bacterial losses that occur during the experimental procedure. The calibration curves constructed showed a positive correlation between the amount of bacteria and the amount of gDNA extracted, both for samples of bacterial suspensions and biofilm suspensions, in a range between 1×108 cells/mL and 1×103 cells/mL. The accuracy of the curves was assessed by performing mock cultures, which verified that there were no significant errors in samples at high concentrations (108 cells/mL) or at low concentrations (103 cells/mL). Furthermore, the biofilm development assays using calibration curves revealed to be useful for monitoring the evolution of the 3 bacteria over time, showing a higher constitution of G.vaginalis, followed by F.vaginae and finally P.bivia. In summary, the results obtained proved that the strategy chosen to construct calibration curves containing an external normalizer can provide a reliable diagnostic method for BV. Further studies are necessary, mainly to evaluate the curves in vaginal samples, since in vitro studies do not mimic the complex diversity of the vaginal microbiota in vivo.Cerca, NunoUniversidade do MinhoPinto, Ana Sofia Gonçalo2023-11-242023-11-24T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/1822/88362por203490967info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-02-03T01:20:34Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/88362Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T02:07:30.354489Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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