Role of RHBDD2 in membrane trafficking regulation

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Hu, Tianyi
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/22491
Resumo: Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
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spelling Role of RHBDD2 in membrane trafficking regulationRHBDD2Superfamília romboideControlo de qualidade do REFragmentação do GolgiRetinitis pigmentosaTeses de mestrado - 2015Departamento de Biologia AnimalTese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015RHBDD2 é parcialmente relacionada com romboides, protéases intra-membranares que degradam substratos na via secretora. Curiosamente, um subgrupo da família romboide, incluindo a RHBDD2, não tem resíduos catalíticos essenciais. Estas “pseudo-proteases” são conservadas, o que implica uma pressão seletiva para manter a sua função durante a evolução. Recentemente, uma mutação pontual (R85H) foi identificada no gene humano que codifica para a proteína RHBDD2, e está associada a uma doença neuro-degenerativa chamada Retinitis Pigmentosa (RP). Esta mutação pontual de G para A, alterou o aminoácido codificado de arginina para histidina no códão 85 do Segundo exão. No entanto a relevância fisiológica da RHBDD2 e a sua contribuição para a doença acima referida não é clara. Os dois maiores focos deste estudo foram (1) a investigação de como a mutação R85H na RHBDD2 contribui para a doença a nível celular; (2) investigar a função da RHBDD2 nativa a nível da célula e do organismo. Vários programas de alinhamento (ClustalO, muscle, tcoffee ferramentas de alinhamento) foram usados para prever a topologia da RHBDD2. Com base na comparação com outros membros da superfamília romboide, os domínios transmembranares (TMD) da RHBDD2 foram previstos. Após identificar cuidadosamente todos os aminoácidos chave nos alinhamentos, eu previ que a RHBDD2 é uma proteína transmembranar com 6 TMD, com ambas as terminações N- e C- presentes na face citoplasmática. Devido ao conhecimento prévio de que a RHBDD2 é expressa em níveis elevados na retina, consistente com a expressão a nível do mRNA na base de dados bioGPS, células de ratinho RPE foram selecionadas como materiais essenciais para as seguintes experiências. Plasmídeos para a sobre-expressão da RHBDD2 WT e da mutação R85H com uma tag de HA no C-terminal foram gerados no vector pLEX MCS, e usados para gerar células estáveis por transdução lentiviral. Estas linhas celulares juntamente com a linha celular com o vector vazio (EV) foram usadas para investigar a função da RHBDD2 a nível bioquímico e da biologia celular. Surpreendentemente, a expressão da forma mutante da RHBDD2 em células RPE, não induziu um stress constitutivo do retículo endoplasmático (RE). Não houce degradação da proteína mutante na linha celular R85H. Isto permitiu-me propor de forma preliminar, que o fenótipo da mutação R85H não é causado por stress do (RE). Por forma a analisar a localização do Et e mutante R85H, células RPE foram marcadas com um anticorpo anti-HA (para detectar RHBDD2 WT e mutante R85H) e com o marcador de stress do RE Calreticulin ou o marcador do cis-Golgi GM130. Imagens de imuno-fluorescência e co-localização mostraram que tanto a WT como a mutante RHBDD2 localizam predominantemente no aparelho de Golgi. Indicando que a mutante R85H localiza-se no mesmo compartimento celular que a proteína nativa, sugerindo que o fenótipo da doença não é causado por stress do RE ou por falta de folding da proteína. Ratinhos com deleção genética (KO) na RHBDD2 foram gerados pelo sistema CRISPR/Cas9 para definir a função da RHBDD2 e o fenótipo dos animais mutantes. Infelizmente, 5 animais fundadores morreram no primeiro dia de vida. Analise do tecido revelou que dois deles tinham INDELs e três deles eram nativos. Logo, a morte dos animais é pouco provável estar relacionada com o genótipo RHBDD2. A experiência foi repetida e 17 potencias fundadores foram obtidos. Resultados de sequênciaçao indicaram que dois animais fundadores tinham a mutação desejada, provavelmente como quimeras. Identificamos também animais fundadores com INDELs de 6 e 9 pares de bases. Experiências de imuno-precepitação acopladas a espectrometria de massa foram realizadas para identificar novos interactores da RHBDD2. Três IPs foram efetuados em diferentes condições (com ou sem crosslinker, acoplado com diferentes tampões de lavagem). Golgins (GM160, Golgin-84, Golgin-45), que atuam como plataformas de acoplamento membranar, foram co-immuno-precepitadas coma RHBDD2 em ambas as experiências com cross-linker, indicando que a RHBDD2 pode ter um papel na manutenção da estrutura do aparelho de Golgi. Componentes chaves das vesículas COPII foram também capturados nos IPs crosslinked e não crosslinked, indicando que a RHBDD2 pode contribuir para o transporte ER para Golgi dependente de COPII. Estes dois grupos apareceram tanto nos IPs da proteína RHBDD2 nativa como mutante R85H. De notar, o número total de identificações de peptídeos está diminuído em IPs de R85H em condições de crosslinking ou na sua ausência, indicando talvez que o mutante R85H, exibe uma alteração conformacional que resulta numa mudança de repertório de interactores. De acordo com as IPs, experiências de fragmentação do Golgi e da sua reorganização, foram efectuadas com RNA de interferência curto (siRNA) para fazer a atenuação da expressão (KD) de RHBDD2 em células HeLa. /2 horas após a transfecçao, as células foram tratadas com BFA, e depois a droga foi removida do meio. De seguida, as células foram fixadas a diferentes pontos de incubação. Esta experiência não resultou em nenhuma diferença óbvia, na cinética de da morfologia do aparelho de Golgi entre as células tratadas control ou com o KD, mas é importante notar que o siRNA não promove a atenuçao complete da expressão da RHBDD2, logo a presença de alguma RHBDD2 residual pode ter prevenido a observação de um fenótipo mais marcado. O papel fisiológico da RHBDD2 permanece desconhecido. Considerando os possíveis parceiros de ligação da RHBDD2 e a localização da RHBDD2, eu proponho que trabalho future se deva focar no teste do tráfego celular e da glicosilação em células sem expressão de RHBDD2 (KO). Também seria útil gerar um mutante R85H endógeno nas células RPE para avaliar a patologia da mutação, e claro, para avaliar o fenótipo dos ratinhos mutantes.Adrain, ColinRodrigues, GabrielaRepositório da Universidade de LisboaHu, Tianyi2016-02-01T14:48:03Z201520152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/22491TID:201064456enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:09:45Zoai:repositorio.ul.pt:10451/22491Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:40:05.170500Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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