The effect of natural compounds on PC12 cell viability in the absence and presence of reactive oxygen species

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Guerra, Sandra Paula Fernandes
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/36089
Resumo: Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017
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spelling The effect of natural compounds on PC12 cell viability in the absence and presence of reactive oxygen speciesNatural compoundsCell viabilityOxidative stressAnnexin A2NeurodegenerationMestrado Integrado - 2017Ciências da SaúdeTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017To this day, natural compounds have been regarded as “a continuing source of novel drug leads”, with naturally inspired drugs and potential drug candidates being studied in the urgent need for new medicines and therapies for major health disorders, such as neurological diseases - one of today’s greatest threats to public health. However, the complexity of the neurodegenerative processes has made it difficult for an effective drug to be discovered. Recently, it has been suggested that acting against a single pathogenic mechanism might prove insufficient to face the multifactorial nature of neurodegenerative disorders and that multiple approaches must be pursued. Therefore, oxidative stress, a common mechanism of neurodegeneration, is addressed in this study as a potential therapeutic option. The effect of several natural compounds on PC12 cell viability in the absence and presence of H2O2-induced cell death was investigated, together with their influence in the expression of Annexin A2, which was recently proposed to protect cells and tissues from oxidative damage. Beforehand, the effect of a library of twenty natural compounds (2 nM to 20 µM) on cell viability was investigated in PC12 cells, both in the absence and presence of H2O2. As none of the compounds exhibited a clear influence on cell viability at these concentrations, four compounds (sciadin, dimethyl sciadinonate, naringenin (3→6’’) luteolin and mefenamic acid) were selected and tested in further detail on a wider concentration range (2 nM to 1 mM). Sciadin presented the most promising results, exhibiting no cytotoxicity and contributing for cellular recovery upon oxidative damage. If a transient increase in the expression of AnxA2 is confirmed, sciadin could be a potential antioxidant candidate to address the pathological oxidative stress observed in neurodegeneration. Although the other compounds induced a slight but significant increase in cell viability before and after H2O2 administration, they did not affect AnxA2 (dimethyl sciadinonate, naringenin (3→6’’) luteolin), or led to a significant increase in cell death in the absence of the toxic stimuli (naringenin (3→6’’) luteolin and mefenamic acid). Nevertheless, a considerable amount of additional work is required before we can learn which (if any) of the given twenty compounds are strong antioxidant drug candidates to treat neurological diseases.Ao longo de milénios, a contribuição de produtos naturais para a medicina e saúde tem sido de extrema importância. Ainda hoje, os compostos naturais são considerados “uma fonte contínua de identificação de novos fármacos” pelo que, medicamentos ou potenciais fármacos, derivados de fontes naturais, são estudados no seguimento de uma necessidade urgente de novas terapêuticas para patologias tão nefastas como o cancro ou as doenças neurológicas. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, devido ao prolongamento da esperança média de vida e ao envelhecimento da população a nível mundial, os distúrbios neurológicos são uma das maiores atuais ameaças à saúde pública. Assim, torna-se essencial que tratamentos ou intervenções profiláticas eficazes sejam descobertos num futuro próximo, ou os custos sociais, financeiros e emocionais das doenças neurológicas tornar-se-ão avassaladores. No entanto, no caso das doenças neurodegenerativas, a complexidade dos mecanismos patológicos que promovem a neurodegeneração tem dificultado a descoberta de fármacos eficazes no tratamento destas patologias. Deste modo, umas das principais linhas de investigação nesta área tem como objetivo identificar as principais causas de desencadeamento dos processos neurodegenerativos e desenvolver formas de os modelar de forma específica. Ainda assim, foi recentemente sugerido que a ação contra um só mecanismo patológico, mesmo com elevada potência e seletividade, pode não ser suficiente para fazer face ao carácter multifatorial das doenças neurodegenerativas, e que uma abordagem múltipla deve ser desenvolvida. Consequentemente, o stress oxidativo, um mecanismo patológico comum a vários distúrbios neurodegenerativos, foi selecionado como potencial alvo-terapêutico no presente estudo. Foi investigado o efeito de vários compostos naturais na viabilidade de células PC12, na ausência e na presença de espécies reativas de oxigénio (reactive oxygen species - ROS), bem como a influência destes mesmos compostos na expressão da anexina A2 (AnxA2), uma nova proteína reguladora dos mecanismos de oxidação-redução a nível celular. A AnxA2 tem sido envolvida numa quantidade crescente de patologias prevalentes, desde doenças neurológicas e autoimunes, a diversos tipos de cancro. Apesar das suas já conhecidas numerosas funções, rigorosamente reguladas por modificações pós-tradução, foi ainda recentemente proposto um papel na proteção de células e tecidos contra o dano oxidativo. A AnxA2 interage diretamente com o peróxido de hidrogénio (H2O2) de forma reversível, pelo que uma única molécula de anexina A2 é capaz de inativar várias moléculas de H2O2. Foi ainda publicado um estudo que demonstra o seu papel na proteção do DNA contra as espécies reativas de oxigénio e tem sido sugerido que um aumento na expressão de AnxA2 pode constituir uma adaptação ao stress oxidativo. Em função destes dados, deduz-se que um composto capaz de aumentar de forma transiente os níveis de expressão de AnxA2, seria um potencial antioxidante exógeno, apto a reduzir o dano oxidativo celular. Foram então fornecidos vinte compostos naturais, cujo efeito na viabilidade celular, tanto na ausência como na presença de espécies reativas de oxigénio, tinha sido previamente testado dentro de uma gama de concentrações mais baixa (2 nM a 20 µM). Como nenhum dos compostos demonstrou influenciar de forma clara a viabilidade celular, foram selecionados quatro compostos (esciadina, dimetil-esciadinonato, naringenina(3→6’’)luteolina e ácido mefenâmico) que foram estudados com maior detalhe numa gama de concentrações mais ampla (2 nM a 1 mM). Foi estudado o efeito destes compostos na viabilidade celular, tanto na ausência de tóxico, de modo a avaliar a sua possível citotoxicidade, como na prevenção do dano oxidativo e na recuperação após dano oxidativo. As alterações na viabilidade celular foram detetadas através do método fluorométrico CellTiter-Blue® (CTB). A esciadina foi o composto natural que apresentou resultados mais promissores, dado que não demonstrou citotoxicidade e potenciou de forma dose-dependente a viabilidade celular após exposição a ROS, contribuindo deste modo para a recuperação celular após dano oxidativo. Para além disso, a exposição a este composto aumentou os níveis de expressão de AnxA2. No entanto, uma vez que um aumento continuado na expressão desta proteína está geralmente associado a um fenótipo invasivo e metastático de uma grande variedade de cancros, torna-se necessário investigar mais detalhadamente o caráter deste aumento de expressão. Caso se revele transiente e fisiologicamente seguro, a esciadina poderá eventualmente vir a ser um fármaco antioxidante com potencial aplicação no stress oxidativo excessivo que é verificado nos processos neurodegenerativos. O dimetil-esciadinonato apresentou um efeito na viabilidade celular muito semelhante, embora mais fraco, de forma geral, comparativamente à esciadina, o que pode resultar da sua estrutura molecular estreitamente relacionada. Curiosamente, ao contrário da esciadina, a exposição a este composto não parece afetar os níveis de expressão de AnxA2, o que pode significar que os grupos funcionais específicos da esciadina poderão ser responsáveis por desencadear o mecanismo pelo qual este composto aumenta a expressão de AnxA2. Para além disso, o dimetil-esciadinonato pode ainda ser uma alternativa, caso a exposição à esciadina se venha a demonstrar prejudicial ao organismo devido um aumento sustentado na expressão de anexina A2. O potencial antioxidante da naringenina(3→6’’)luteolina é mais questionável, dado que este composto manifestou citotoxicidade generalizada, principalmente em concentrações mais elevadas. Concentrações inferiores demonstraram influenciar de uma forma positiva a viabilidade celular na presença de ROS, em particular na prevenção de dano oxidativo. No entanto, torna-se necessária uma posterior verificação destes resultados, dada a variabilidade encontrada nos resultados obtidos com baixas concentrações, devida eventualmente à elevada viscosidade e difícil solubilidade deste composto. Devem ainda ser realizados estudos toxicológicos que permitam determinar a segurança da naringenina(3→6’’)luteolina, tanto in vitro como in vivo. O ácido mefenâmico manifestou um duplo efeito na viabilidade celular: concentrações mais baixas potenciaram a viabilidade celular, enquanto que concentrações mais elevadas provocaram citotoxicidade significativa. No entanto, as concentrações inferiores não apresentaram os efeitos positivos que seria de esperar relativamente à viabilidade celular na presença de ROS, considerando o potencial antioxidante e neuroprotetor sugerido para este composto. Deste modo, devem ser testadas diferentes abordagens, como a exposição a níveis menos acentuados de H2O2 (que se traduzem em danos oxidativos mais moderados, o que acontece em estados patológicos mais precoces), ou o prolongamento do tempo prévio de incubação com ácido mefenâmico. Curiosamente, ambas as concentrações testadas aumentaram proporcionalmente os níveis de expressão de anexina A2. Contudo, apesar de ter sido determinado o efeito dos compostos selecionados na viabilidade celular de células PC12, considerado o seu efeito tanto na ausência como na presença de ROS e ter sido identificada uma correlação entre a exposição a estes compostos naturais e níveis de expressão de AnxA2 alterados, os mecanismos bioquímicos subjacentes a estes resultados não foram ainda determinados. Para além disso, o efeito na viabilidade celular dos restantes compostos naturais fornecidos, bem como a sua influência na expressão de AnxA2, está ainda por estudar. Assim, é necessário um volume considerável de investigação adicional para averiguar se algum destes compostos poderá vir a ser um potencial fármaco antioxidante, capaz de fazer face ao stress oxidativo que desempenha um papel determinante na progressão das doenças neurodegenerativas.Vedeler, AnniRodrigues, ElsaRepositório da Universidade de LisboaGuerra, Sandra Paula Fernandes2018-12-19T18:34:13Z2017-10-2320172017-10-23T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/36089enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:32:28Zoai:repositorio.ul.pt:10451/36089Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:50:24.950725Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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