Análise por RMN do perfil metabolómico de proteínas que sofrem agregação e unfolding num sistema modelo de levedura para doenças neurodegenerativas

• Autor(a) principal: Ribeiro, Cláudia Patrícia Santos
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/25077

O processo de folding das proteínas é vital para a homeostase celular, por isso os organismos têm sistemas altamente desenvolvidos para degradação de proteínas misfolded. No entanto, quando esses sistemas funcionam mal a viabilidade celular e do organismo podem ser comprometidas, levando ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, caracterizadas pela presença de agregados proteicos. Atualmente, uma parte da investigação nesta área está focada no estudo da base molecular deste tipo de agregados e consequente identificação de novos alvos terapêuticos com vista ao desenvolvimento de soluções terapêuticas inovadoras. Estudos anteriores mostraram que a sobre-expressão de proteínas relacionadas a ELA (OPTN, TDP e FUS) num sistema modelo de levedura resulta num crescimento mais lento em comparação aos controlos. Além disso foram também verificadas diferenças nos perfis metabólicos. Para determinar se as respostas metabólicas são devido a perturbações específicas do metaboloma das proteínas relacionadas com ELA ou se são respostas gerais não específicas a qualquer proteína agregada ou unfolded sobre-expressa, neste projeto foram usadas 3 variantes de lisozima humana sobre-expressa em S. cerevisiae Y7092 (wild-type, no estado unfolded (T70N) e no estado propenso à agregação (I56T)) e obtidos os respetivos perfis metabólicos por RMN. Os resultados da sequenciação indicaram que a variante T70N não tinha sido inserida no plasmídeo de expressão. A toxicidade da lisozima sobre-expressa foi determinada usando spot tests. Nas curvas de crescimento verificou-se que existia uma diferença entre as variantes. Para obter o perfil metabólico por RMN, as células foram cultivadas a 30ºC em galactose e recolhidas após 72h. Foram utilizados extratos de fase aquosa e os perfis mostraram diferenças metabólicas entre as variantes WT e I56T.