Unravelling new ethnopharmacological roles of Plectranthus species: biological activity screening

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Andrade, Joana Eulália da Cruz Marçalo de
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/34349
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016
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spelling Unravelling new ethnopharmacological roles of Plectranthus species: biological activity screeningPlectranthus spp.Anti-inflammatoryAntioxidantSkin enzymatic inhibitionMycobacterium tuberculosisTeses de mestrado - 2016Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016This dissertation focused on the biological activity screening of several Plectranthus spp. plants, aiming to unravell novel ethnopharmacological roles and further research, of several extracts (methanol, ethyl acetate, acetone and water) and isolated compounds. Previous evidences on interesting biological activities of Plectranthus spp. constituents, directed the study for antioxidant, anti-skin ageing, anti-inflammatory, and anti-mycobacterial activities. Antioxidant results revealed an increased activity of the methanol extracts (20-76%), due to the presence of polyphenols widely known as antioxidants. Moreover, P. grandidentatus (62.3 ± 0.43%) and P. ecklonii (55.5 ± 1.66%) registered a high scavenging activity in the ethyl acetate extract, in comparison with quercetin (89.0 ± 2.5%), most likely due to the presence of abietane diterpenes. Acetylcholinesterase (AChE) was studied in vitro to evaluate the enzymatic inhibition, due to recent discoveries on non-neuronal cholinergic system in the skin. This assay showed that the Plectranthus spp. organic extracts did not significantly inhibited AChE. Concerning the tyrosinase inhibition assay, it was observed a high inhibition for the P. ecklonii methanol (65.9 ± 3.42%), P. grandidentatus acetone (67.9 ± 3.55%), and P. saccatus acetone (56.5 ± 5.68%) organic extracts. On the other hand, the aqueous extract of P. porcatus was the only one that showed enzymatic inhibition (65.0 ± 8.67%). From the tested isolated compounds, abietane diterpenes, mainly present in the organic extracts of P. grandidentatus, P. madagascariensis, and P. ecklonii were highly active against tyrosinase, in more than 46% and up to 75%, especially compared to kojic acid (92.9 ± 7.28%). In the collagenase assay, all tested extracts and compounds showed a high enzymatic inhibition which was in the range of 28-76%. The higher inhibition results were obtained from P. neochilus methanol extract (76.4 ± 2.09%), P. ecklonii aqueous extract inhibited (75.59 ± 6.5%) and rosmarinic acid (44.78 ± 4.53%), in comparison with epigallocatechin gallate (93.1 ± 5.27%). In contrast to the results of the previous enzymatic assays, the anti-elastase assay revealed that in general the extracts did not decrease elastase activity (30-42%). Nonetheless, the isolated compounds were tested, and they were able to highly inhibit elastase activity. Particularly, the oleanolic:ursolic acids mixture (1:4) with 63.4 ± 2.56% and Parvifloron D with 52.8 ± 3.76%, were the most efficient in elastase inhibition specially compared with ursolic acid used as positive control (69.9 ± 3.65%). The anti-inflammatory assay was performed by the quantification of NO production using the Griess reaction. The non-cytotoxic isolated compounds revealed to be unable to reduce NO production, after LPS stimulated inflammation (ranging from 16-23 μM), in comparison with the normal quantities of NO production within the cells (17.7 ± 0.67 μM), and with the positive control L-NAME that decreased NO until reaching 3.9 ± 0.24 μM. Finally, the preliminary results of Mycobacterium tuberculosis H37Rv growth assay, revealed low CFU/mL (dilution 10-3) especially regarding one halimane diterpene compound (2.1×105 CFU/mL), similar to the positive controls isoniazid (1.2×105 CFU/mL), and ethambutol (2.0×105 CFU/mL), suggesting a potential alternative for further anti-tubercular studies. Overall, according to the references of this study, this was the first report on Plectranthus spp., concerning the assays of skin-related enzymatic inhibition in vitro, anti-inflammatory assay, and Mycobacterium tuberculosis H37Rv growth, with a preliminary scientific validation upon known ethnopharmacological uses.As plantas do género Plectranthus L’Héritier (família Lamiaceae) são selecionadas em várias investigações científicas devido aos vários usos etnofarmacológicos pelas populações indígenas, e facilidade de crescimento em zonas temperadas. Estas plantas são compostas por cerca de 350 espécies reconhecidas pelos seus óleos essenciais e compostos terpénicos. Nesta dissertação pretendeu-se desenvolver e complementar o screening de várias atividades biológicas, a partir de extratos e compostos isolados de sete espécies de Plectranthus (P. grandidentatus Gürke, P. ecklonii Benth., P. ornatus Codd., P. madagascariensis (Pers.) Benth., P. porcatus van Jaarsv. & P.J.D.Winter, P. neochilus Schltr., e P. prostratus Gürke). Estes estudos biológicos envolveram a pesquisa de atividades antioxidante, anti-envelhecimento da pele, anti-inflamatória e anti-micobacteriana. Foram obtidos vinte e oito extratos (sete aquosos e vinte e um orgânicos, nomeadamente de acetona, metanol e acetato de etilo) de todas as plantas em estudo, obtendo-se os resíduos secos (mg de extrato/g de planta). Nos resultados preliminares da atividade antioxidante executada pelo método da recaptação do radical DPPH, verificou-se que os extratos de metanol detiveram os valores mais elevados de recaptação de radicais livres (20-76%), e, portanto, de maior atividade antioxidante. Concluiu-se que esta atividade poderá estar relacionada com as elevadas quantidades em polifenóis nos extratos metanólicos, amplamente citados como antioxidantes. Adicionalmente, foi também registada uma elevada atividade antioxidante para os extratos de acetato de etilo de P. ecklonii (55.5 ± 1.66%) e P. grandidentatus (62.3 ± 0.43%), muito provavelmente devido à presença de diterpenos abietânicos. Na verdade, estes foram os resultados que demonstraram maior atividade antioxidante comparável ao controlo positivo usado, quercetina (89.0 ± 2.5%). A acetilcolinesterase (AChE, EC 3.1.17), conhecida pela sua ação na terminação do impulso nervoso pela hidrólise da acetilcolina, produzindo colina, foi estudada in vitro usando o método de Ellman, de modo a avaliar a inibição enzimática pelos extratos e/ou compostos isolados. Este ensaio foi realizado com base nos dados recentes da literatura, evidenciando um sistema colinérgico não-neuronal pela presença de acetilcolina na pele (humana). Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que nenhum dos vinte e um extratos orgânicos estudados inibiram a AChE no ensaio enzimático in vitro. Relativamente aos ensaios in vitro de inibição enzimática relacionada com a pele, o ensaio de inibição da tirosinase (EC 1.14.18.1), uma monooxigenase de cobre que catalisa a síntese de melanina pela produção de L-DOPA a partir de L-tirosina, revelou que os extratos orgânicos de P. ecklonii metanol (65.9 ± 3.42%), P. grandidentatus acetona (67.9 ± 3.55%), e P. saccatus acetona (56.5 ± 5.68%), diminuíram significativamente a atividade enzimática da tirosinase. Por outro lado, o extrato aquoso de P. porcatus foi o único a exibir inibição enzimática da tirosinase (65.0 ± 8.67%). De modo a confirmar a atividade registada para os extratos, foram testados os compostos isolados. De facto, os compostos abietânicos (maioritariamente presentes nos extratos orgânicos de P. grandidentatus, P. madagascariensis, e P. ecklonii) demonstraram forte atividade contra a tirosinase, em mais de 46% e até 75%, especialmente em comparação com o ácido kójico (92.9 ± 7.28%). Relativamente ao ensaio enzimático de inibição da colagenase (EC 3.4.24.3, metaloproteinase envolvida na clivagem do colagénio), todas as amostras inibiram, de um modo geral, a atividade enzimática (28-76%). Na verdade, o extrato metanólico de P. neochilus inibiu a colagenase em 76.4 ± 2.09%, bem como o extrato aquoso de P. ecklonii (75.6 ± 6.5%) e o composto ácido rosmarínico em 44.78 ± 4.53%. Estes resultados preliminares sugerem que a presença de compostos polifenólicos e diterpenos abietânicos nos extratos de Plectranthus, têm uma elevada eficiência inibitória da colagenase semelhante à epigallocatequina galhato (93.1 ± 5.27%). Em contraste com o que foi obtido nos ensaios enzimáticos da tirosinase e da colagenase, no ensaio enzimático de inibição da elastase (EC 3.4.21.36, protease de serina envolvida na quebra da elastina) não foi observada a diminuição da atividade enzimática após tratamento com os vinte e oito extratos de Plectranthus (30-42% de inibição enzimática). No entanto, os compostos isolados testados demonstraram uma elevada inibição. Particularmente, esta ação foi observada para a mistura de ácidos oleanólico:ursólico 1:4 (63.4 ± 2.56%) e para a Parviflorona D (52.8 ± 3.76%), em comparação com o ácido ursólico usado como controlo positivo (69.9 ± 3.65%). De um modo geral, os extratos e/ou compostos isolados das sete espécies de Plectranthus, revelaram uma elevada capacidade, como redutores da híper pigmentação da pele (provocada pela atividade excessiva da tirosinase), e na manutenção da integridade dérmica, através da manutenção de colagénio e elastina, pela inibição da colagenase e da elastase. Assim, em conjunto com a atividade antioxidante contra a produção de ROS, e na inibição de enzimas relacionadas com a integridade dérmica e pigmentação, será possível o desenvolvimento de uma aplicação cosmética em ensaios futuros. Por outro lado, a capacidade anti-inflamatória dos compostos foi avaliada através da inibição da produção de NO, usando a reação de Griess. Assim, após a avaliação da citotoxicidade dos compostos testados (em várias concentrações) através do ensaio MTT, foi medida a inflamação em células de macrófagos RAW 264.7. Após estimulação da inflamação celular com LPS, e tratamento com os compostos não tóxicos, este ensaio revelou que os compostos testados não foram capazes de reduzir a produção de NO (16-23 μM), em comparação com a quantidade de NO produzida naturalmente pelas células (17.7 ± 0.67 μM) e com o L-NAME, usado como controlo positivo (3.9 ± 0.2 μM). Uma vez que a inflamação não é apenas proporcional à produção de NO, mas também de outros mediadores inflamatórios, será necessário expandir a investigação desta atividade biológica. De modo a compreender, se de facto, os compostos isolados de Plectranthus são anti-inflamatórios por outros mecanismos, como por exemplo, por inibição enzimática da ciclooxigenase-2 (COX-2). Finalmente, foi avaliado o crescimento de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) H37Rv após a infeção de macrófagos, derivados de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Numa primeira abordagem, o crescimento bacteriano foi monitorizado pela contagem de unidades formadoras de colónias (UFC), nas primeiras horas de infeção, e 13 dias após infeção e tratamento com os compostos selecionados. Após a normalização dos valores de UFC/mL, os resultados revelaram uma diminuição substancial de colónias de Mtb (na diluição 10-3), apenas após o tratamento com um composto halimano obtido por hemi-síntese (2.1×105 UFC/mL). Este resultado foi muito semelhante ao dos controlos positivos aplicados, isoniazida (1.2×105 UFC/mL) e etambutol (2.0×105 UFC/mL), sugerindo a possível aplicabilidade deste tipo de compostos em estudos futuros de terapia anti-tuberculose. Dado o resultado deste halimano na notável diminuição de colónias de Mtb, será relevante prosseguir na possível avaliação do mecanismo de ação que conduziu à inibição do crescimento bacteriano. Para tal, poder-se-ão aplicar técnicas de Western blot e imunofluorescência usando marcadores de autofagia, e avaliar a biogénese do fagolisossoma pelos macrófagos infetados. No geral, de acordo com as referências consultadas, são aqui reportados os primeiros estudos em ensaios de inibição de enzimas relacionadas com a pele, na atividade anti-inflamatória por via do NO, e na atividade anti-tuberculose de extratos e compostos isolados de Plectranthus. Os resultados obtidos nesta dissertação fornecem uma validação científica preliminar, sobre os usos amplamente conhecidos e reportados, por estas plantas medicinais. Na verdade, são necessários mais estudos na pesquisa de novos alvos terapêuticos mais específicos e com menos efeitos adversos, a partir das atividades etnofarmacológicas de Plectranthus reportadas até agora. Assim como validações científicas no uso de produtos à base de plantas usados no tratamento, cura e prevenção de doenças. Uma vez que os produtos naturais representam uma fonte única de compostos protótipo no desenvolvimento de novos fármacos, os metabolitos secundários isolados de Plectranthus revelam neste estudo, o seu potencial no design de novos medicamentos.The presented thesis project was performed at the Food Sciences and Phytochemistry research group at the Research Center for Biosciences & Health Technologies (CBIOS) of Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias (ULHT), under the supervision of Professor Doctor Patrícia Dias Mendonça Rijo, Ph.D and co-supervision of Professor Doctor Célia Maria Cardona Faustino, Ph.D. Part of the research was developed under the Short-Term Scientific Mission of COST action CM1407 entitled “Natural diterpenoids as potential anti-tubercular drugs”, developed at the National Institute for the infectious Disease Lazzaro Spallanzani, Laboratorio di Biologia Cellulare e Microscopia Elettronica, Rome, Italy, under the supervision of Doctor Gian Maria Fimia, and co-supervision of Doctor Alessandra Romagnoli. Additionally, some research was developed at the Centre for Marine Sciences (CCMAR), at the MARbiotech laboratories, University of Algarve, Faro, Portugal, under the supervision of Doctor Luísa Custódio.Rijo, Patrícia Dias de MendonçaFaustino, Célia Maria CardonaRepositório da Universidade de LisboaAndrade, Joana Eulália da Cruz Marçalo de2018-07-25T16:13:01Z2016-11-082016-09-152016-11-08T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/34349TID:201487225enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:29:36Zoai:repositorio.ul.pt:10451/34349Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:49:04.441694Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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