Implementação de uma metodologia para análise metagenómica do microbioma humano em amostras com baixa biomassa de microrganismos

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Durão, Dina Isabel Filipe Carpinteiro
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/48699
Resumo: Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
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spelling Implementação de uma metodologia para análise metagenómica do microbioma humano em amostras com baixa biomassa de microrganismosSequenciação de próxima-geraçãobioinformáticametagenómicagene 16S rRNAcontaminantesTeses de mestrado - 2020Departamento de Biologia AnimalTese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020O corpo humano é colonizado por um grande conjunto de microrganismos que vivem em simbiose com o homem. Desta colonização fazem parte bactérias, fungos, vírus e protozoários, que se espalham ao longo das superfícies externas e internas do corpo, criando microbiomas com características e funções específicas. Os estudos do microbioma vieram beneficiar de forma significativa dos avanços das novas tecnologias de sequenciação ("next-generation sequencing"), as quais permitem sequenciar elevadas quantidades de DNA a um custo muito reduzido. No entanto, este tipo de estudos também acarreta algumas dificuldades, nomeadamente a presença de uma pequena biomassa de microrganismos em alguns locais do corpo e a contaminação com estirpes ambientais durante a colheita e processamento das amostras. Neste trabalho foi implementada uma metodologia para analise de contaminantes em amostras com baixa biomassa. Para este objectivo, foi extraído DNA genómico de 34 amostras de tecido renal tumoral em 9 séries de extração, tendo sido incluído 1 controlo branco em cada procedimento de extracção. Os DNAs foram amplificados por nested PCR para a região V3 e V4 do gene 16S rRNA, tendo sido incluído um controlo negativo da PCR por cada conjunto de amostras amplificadas. Os amplicões do gene 16S rRNA compreenderam um total de 96 amostras e controlos, incluindo duplicados que foram sequenciados em plataforma Illumina, tendo-se obtido um total de 47.3 milhões de reads. Estas reads foram tratadas e processadas usando a plataforma bioinformática QIIME2. Após a filtragem e o denoising das reads, a análise taxonómica revelou a presença de 19 filos, 27 classes, 55ordens, 75 famílias, 89 géneros e 114 espécies distintas em amostras e controlos. Usando o pacote Decontam do R, foram identificados 35 géneros contaminantes nos controlos da extracção e 17 géneros contaminantes foram identificados nos controlos da PCR. A proporção de contaminantes nas amostras de DNA variou entre 0,01% e 24,8%. Entre estes, foram detectados 9 géneros que não estão normalmente presentes como contaminantes em estudos de metagenómica, pelo que a sua detecção neste estudo permitirá analisar com cautela os resultados de futuras amostras com estes géneros. Uma vez que a maioria dos géneros contaminantes foi detectada nos controlos da extracção, deve ser dada especial atenção à pureza e manipulação dos reagentes utilizados na preparação das amostras. Dos géneros contaminantes detectados, 9 não foram referidos em outros estudos como contaminantes, indicando que a presença destes microorganismos em estudos de microbioma futuros, devem ser interpretados com precaução. Concluímos que as estirpes contaminantes são um problema sério em estudos de microbioma, em amostras com baixa biomassa e que a metodologia apresentada aqui é uma abordagem eficiente para detectar e quantificar essas estirpes contaminantes.The human body is colonized by a large group of microorganisms that live in symbiosis with humans. This colonization includes bacteria, fungi, viruses and protozoa, which spread along the external and internal surfaces of the body, creating microbiomes with specific characteristics and functions. Studies of microbiome benefited significantly from advances in new sequencing technologies ("next generation sequencing"), as these allow sequencing high amounts of DNA at low costs. However, this type of studies also brings difficulties, namely the presence of small biomasses of microorganisms in some parts of the body, which poses technical limits to their detection, and contamination with environmental strains during the collection and processing of samples, which may interfere with the true taxonomic profile of microorganism communities. In this work, a methodology for the analysis of contaminants in low biomass samples was implemented. For this purpose, nine DNA extraction procedures were performed, comprising a total of 34 tumoral renal tissue samples, each of which included a reagent only (negative) control. The DNAs were amplified by nested PCR for a V3-V4 region of the 16S rRNA gene, and a PCR negative control was included in each reaction set. The 16S rRNA amplicons comprising a total of duplicate 96 samples and controls, including duplicates, were sequenced on an Illumina platform, producing a total of 47.3 million reads. These reads were treated and processed using QIIME2 microbiome bioinformatics platform. After filtering and denoising of reads, taxonomy analysis revealed the presence of 19 phyla, 27 classes, 55 orders, 75 families, 89 genera and 114 distinct species in samples and controls. Using the Decontam R package, 35 contaminating genera were identified in the DNA extraction controls and 17 contaminating genera were found in the PCR controls. The proportion of contaminants in DNA samples varied between 0.01% and 24,8%. Since the majority of the contaminating genera were detected in the extraction controls, particular attention should be paid to the preparation and manipulation of the reagents used in DNA extraction procedures. Among the contaminating genera, 9 were not present as contaminants in other studies, indicating that the presence of these microorganisms in future microbiome studies should be interpreted with caution. We conclude that contaminating strains are a serious problem in low biomass microbiome studies and that the methodology presented here is an efficient approach to detect and quantify those strains.Vieira, LuísDias, Deodália Maria Antunes, 1952-Repositório da Universidade de LisboaDurão, Dina Isabel Filipe Carpinteiro2021-06-22T12:22:10Z202020202020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/48699TID:202931358porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:52:05Zoai:repositorio.ul.pt:10451/48699Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:00:28.357800Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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