Amyloids in Nature : structural analysis of sea urchin inspired adhesive protein
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| Data de Publicação: | 2021 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/53618 |
Resumo: | Tese de Mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências |
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Amyloids in Nature : structural analysis of sea urchin inspired adhesive proteinBioadesivosNectinaProteína recombinanteEspécies amiloidesCaracterização estruturalTeses de mestrado - 2022Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de Mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasOs ouriços do mar possuem órgãos adesivos especializados — os pés ambulacrários —, que produzem secreções adesivas e “desadesivas”, possibilitando uma fixação reversível ao substrato. Ao contrário dos adesivos sintéticos, este bioadesivo, oferece maior resistência e eficácia em ambientes aquosos e adere a uma multiplicidade de superfícies, naturais e artificiais, proporcionando ainda uma composição com menos componentes tóxicos, o que o torna um produto mais sustentável do ponto de vista humano e ambiental. Por outro lado, os adesivos dos ouriços do mar apresentam forças adesivas mais baixas do que os adesivos sintéticos, mas mais altas do que outros adesivos biológicos, como a fibrina, que é utilizada como adesivo cirúrgico. Sendo assim é imperativo alargar o nosso conhecimento sobre os bioadesivos marinhos de forma a potenciar o desenvolvimento de novos adesivos biomiméticos para aplicações biomédicas. No entanto, a sua aplicação em larga escala tem como principal dificuldade o facto da quantidade de adesivo produzido pelo organismo ser reduzida, impossibilitando uma eficaz extração diretamente dos tecidos ou secreções. Estudos sobre o bioadesivo do ouriço do mar da espécie Paracentrotus lividus realizados pelo grupo de investigação identificaram como principal componente uma proteína denominada de Nectina. Esta proteína foi identificada pela primeira vez em ovos e embriões da mesma espécie (Uniprot Q70JA0). Nos adultos encontra-se sobre expressa nos discos adesivos dos pés ambulacrários e é secretada para o adesivo. A Nectina possuí várias isoformas glicosiladas e fosforiladas e foram encontradas nos pés ambulacrários mais duas variantes (Variante 2- Uniprot A0A182BBB6; Variante 3- não publicado). Esta proteína tem uma massa molecular de 108 kDa pode formar dímeros e contém seis domínios de tipo discoidina, repetidos em bloco (F5/8 tipos C) que tipicamente ligam moléculas com galactose e com a N-acetilglucosamina, possuindo ainda um motivo LDT que se prevê ser um local de ligação para um recetor de integrina α4/β7 e tem ainda na posição 77 uma tirosina que se prevê que seja um local de sulfatação, referenciado como sendo importante para as proteínas que passam pela via de secreção. Recentemente mostrou-se que o adesivo secretado pelo P.lividus comporta-se como um amiloide funcional, tal como reportado para outros adesivos marinhos. Pensa-se que a presença de proteínas adesivas do tipo amiloide potenciem uma maior força adesiva, conferindo resistência aos adesivos marinhos em que foram identificadas. Estes resultados são fortes indicadores de que a proteína adesiva Nectina, sendo um dos principais componentes do adesivo de P. lividus, tenha um comportamento amiloide. O grupo de proteínas com estas características, tem recebido um amplo interesse por parte de inúmeros projetos de investigação, estando historicamente associado a doenças conhecidas como amiloidoses, que inclui Alzheimer, Parkinson e diabetes. As proteínas amiloides formam agregados altamente estáveis e insolúveis, compostos por fibras que apresentam na sua estrutura central, folhas β organizadas perpendicularmente ao eixo da fibra, estabilizadas por pontes de hidrogénio da cadeia primária do péptido. Para a maior parte das proteínas, a formação de fibras amilóides dá-se em condições desnaturantes, partindo de um estado parcialmente desnaturado com uma estrutura quaternária de baixa energia, havendo maior propensão deste tipo de formações em proteínas com sequências hidrofóbicas com baixo número resíduos com cadeia lateral com carga. Durante a formação deste estado podem ser identificadas diferentes espécies intermediárias, incluindo oligómeros, protofibras e agregados, cada uma delas com múltiplas subespécies. No entanto, torna-se cada vez mais evidente que os amiloides podem também cumprir funções benéficas, o caso do grupo dos amiloides funcionais, considerados ubíquos na natureza, tendo sido identificados num elevado número de organismos, incluindo bactérias, fungos, insetos e mais recentemente em algas e organismos marinhos, entre os quais o ouriço do mar Paracentrotus lividus. Nestes casos, os organismos superam de alguma forma a toxicidade característica destas estruturas e beneficiam das vantagens das mesmas nos seus biomateriais, como elevada força e resistência a degradação. Dada a simplicidade de enrolamento de uma proteína amilóide, as fibras que a constituem são capazes de cumprir um vasto número de funções, como proteção de organismos do meio ambiente e aumento da capacidade adesiva. Esta última característica parece ser muito vantajosa em ambiente marinho, em que as estruturas amiloides parecem estar envolvidas na adesão ao substrato, proteção contra predadores, acesso a recursos vitais e melhoramento de transferência de genes. Com a presente tese pretendemos avaliar a presença de espécies amilóides (fibras e oligómeros) no adesivo secretado, assim como produzir recombinantemente, em laboratório, a proteína Nectina de P. lividus (rNec) de forma a caracterizar a sua estrutura secundária, estabilidade térmica, adsorção a vários materiais (vidro e poliestireno) e eventual formação de espécies amiloides. Desta forma definimos como objetivo principal determinar a estrutura da proteína adesiva recombinante Nectina, inspirada no ouriço do mar P.lividus, e avaliar se possui propriedades amiloides com vista a uma futura aplicação biomédica. Especificamente o trabalho assentou essencialmente em três fases: primeiramente, realizaram-se ensaios com corantes fluorescentes e anticorpos específicos para a deteção e observação de espécies amiloides nos vários tecidos analisados, nomeadamente, os pés ambulacrários e secreção adesiva do ouriço do mar Paracentrotus lividus; de seguida foram otimizadas as condições de expressão e purificação da proteína recombinante Nectina, de forma a produzir a mesma permitindo aferir qual a sua estrutura e de que forma esta é influenciada quando sujeita a diversas condições. Os ensaios histoquímicos com tioflavina-S e -T e imunohistoquímicos com anticorpos que detetam espécies amiloides, revelaram a presença de fibras e oligómeros amiloides na cutícula dos discos adesivos dos pés ambulacrários e na secreção adesiva. Relativamente ao processo de expressão proteica, os melhores resultados de expressão foram obtidos em células E.coli Rosetta em meio LB transformadas com o plasmídeo rNec, induzidas com 1 mM de IPTG, a 37ºC durante a noite. A proteína de interesse, com o peso molecular esperado de 110 kDa, foi identificada em maior quantidade na fração insolúvel, sendo por isso purificada a partir de corpos de inclusão. Na purificação os melhores resultados foram obtidos com 25 mM Tris, 5% Glycerol, 1mM DTT, 0.5 mM PMSF e 8M Urea nos tampões de ligação e eluição, conjugados com um gradiente linear de eluição até 500 mM de imidazol. Desta forma obteve-se uma fração enriquecida com rNec com um rendimento total de cerca de 0,6 mg/g de célula, embora com alguma coeluição de proteínas de E.coli. A fração purificada foi então avaliada quanto à sua estrutura e fold. A análise por dicroísmo circular evidenciou uma estrutura do tipo α/β fold, não tendo sido possível quantificar os diferentes tipos de estrutura devido a baixa razão sinal/ruído dos espectros. Na presença de sal, rNec apresentou um elevado grau de destabilização, sendo este aumento proporcional à concentração do sal. Em termos de adsorção, rNec, apresentou um comportamento semelhante ao Fibrinogénio (percursor da fibrina) em superfícies de vidro e poliestireno nas várias condições testadas. Em vidro e na presença de água do mar, rNec mostrou maior adsorção que o fibrinogénio. Os ensaios de imunohistoquímica, demostraram que é também nestas condições que se detectam mais espécies amiloides (fibras e oligómeros) com rNec e Fibrinogénio. Este trabalho demonstrou que é possível expressar em bactéria uma proteína adesiva inspirada no ouriço do mar, rNec, em quantidades e níveis de pureza compatíveis com uma futura aplicação biomédica. A proteína obtida demonstrou ter características amiloides, mantendo as suas propriedades adesivas. Estes resultados constituem mais um importante passo para o desenvolvimento de um adesivo biomimético inspirado no ouriço do mar Paracentrotus lividus.Sea urchins possess specialized adhesive organs, the tube foot, which produce adhesive and deadhesive secretions, allowing for reversible attachment to the substrate. Unlike synthetic adhesives, this biological adhesive, offers greater resistance and effectiveness in aqueous environments and adheres to a multiplicity of natural and man-made surfaces. On the other hand, sea urchin adhesives show lower adhesive forces in comparison with synthetic adhesives, but higher relatively to other biological adhesives like fibrin, a well known surgical adhesive. For those reasons, it is imperative to increase the current knowledge on marine bioadhesives, to boost the development of new biomimetic adhesives for biomedical aplications. However, one of the main constrains to the use of marine adhesives for practical applications relates to the fact that the adhesive organs produce little amount of these adhesive secretions, making it difficult to extract and purify directly from tissues or secretions. Our research group identified an adhesive protein, Nectin, as the major component of the adhesive material of the sea urchin Paracentrotus lividus. This protein has been shown to be highly overexpressed in P. lividus tube feet discs, being also secreted into the adhesive. Recently, evidence has been produced showing that the adhesive secretion behaves like a functional amyloid, which as been previously shown to occur in other marine adhesives. It is believed that the presence of amyloid-like adhesive proteins contributes to enhance the adhesive strength and resistance of these bioadhesives. Taken together, these results provide strong indications that Nectin, being an important component of the adhesive, most likely behaves like a functional amyloid. For this reason, this project aims at evaluating the presence of amyloid species (fibrils and oligomers) in the secreted adhesive, as well as producing recombinantly, at laboratory scale, P. lividus Nectin (rNec) to characterize its secondary structure, its thermal stability, its adsorpsion to different surfaces (glass and polystyrene) and the possible formation of amyloid species. Histochemistry assays using Thioflavine-S and -T and immunohistochemistry assays with antibodies that detect amyloid species, revealed the presence of amyloid fibrils and oligomers in the tube feet disc cuticle of P. lividus and in the adhesive secretion. As for expression tests, the best rNec expression results were obtained with E. coli Rosetta cells transformed with the rNec plasmid in LB medium, induced with 1 mM IPTG at 37 ºC overnight. A significant amount of protein, with the expected molecular weight of 110 kDa, was expressed in the insoluble fraction, and thus we optimized protein purification from inclusion bodies. For the purification, the best results were obtained using 25 mM Tris, 5% Glycerol, 1mM DTT, 0.5 mM PMSF and 8M Urea in the binding and elution buffers, conjugated with a linear elution gradient up to 500 mM of imidazol. This resulted in a rNec enriched fraction (total yield about 0.6 mg/g of cell), although with some co-elution of E. coli proteins. Then, the purified fraction was characterized regarding is structure and fold. The spectrum showed a combination of α-helix and β-sheets structures. In the presence of salt rNec showed a high degree of destabilization which increases with increasing salt concentrations. In terms of adsorption properties, rNec behaved similarly to Fibrinogen (fibrin precursor) on glass and polystyrene surfaces, in the different tested conditions. On glass and in the presence of artificial sea water, rNec showed higher adsorption than Fibrinogen. The immunohistochemistry assays, also pointed out that it is in these same conditions that more amyloid species are formed (fibrils and oligomers) with rNec and Fibrinogen. The present work demonstrates that it possible to successfully express in bacteria a sea urchin-inspired adhesive protein, rNec, in amounts and degree of purification compatible with a future biomedical application. The obtained protein presented amyloid-like characteristics, maintaining its adhesive properties. These results constitute a step towards the development of a sea urchin inspired adhesive.Santos, Romana Lopes AlmeidaHenriques, BárbaraRepositório da Universidade de LisboaFernandes, André Gonzaga Ribeiro de Castro202220212024-12-31T00:00:00Z2022-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/53618enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:59:35Zoai:repositorio.ul.pt:10451/53618Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:04:34.297712Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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