Produção de proteínas recombinantes inspiradas no adesivo do ouriço do mar e sua adesão a diferentes substratos

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Batista, Joana Domingues Leal
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/42074
Resumo: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
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Por estas razões, poderá vir a ter futuras aplicações biomédicas, no entanto, a quantidade de adesivo secretado é reduzida, pelo que a extração e purificação de proteínas adesivas diretamente dos tecidos ou da secreção é incompatível com uma aplicação prática. Por este motivo, neste estudo, optou-se pela produção de uma proteína recombinante, inspirada na proteína adesiva Nectina, cuja sequência completa é conhecida e que se sabe estar altamente sobre-expressa no disco adesivo dos pés ambulacrários do ouriço do mar P. lividus, sendo também secretada para o adesivo, indicando que está provavelmente envolvida na adesão deste animal ao substrato. Neste trabalho recorremos à produção heteróloga de Nectina (rNec) em Eschrichia coli, otimizando a sua expressão recorrendo a um gene sintético e testando vários meios e condições de crescimento, seguido da otimização da lise celular e purificação da proteína por Cromatografia de Afinidade por Iões Metálicos Imobilizados (IMAC) e caracterização por SDS-PAGE e Western Blotting. As propriedades adesivas da rNec foram testadas em diversas superfícies e avaliadas através de várias técnicas complementares tais como Testes rápidos de revestimento de superfície, Goniometria, Elipsometria, Ressonância de Plasmão de Superfície (SPR) e Microscopia de Força Atómica (AFM). Os resultados obtidos mostram que entre as condições testadas, a melhor forma de produzir a rNec com o vector pHTP1 e em E. coli BL21, é efetuar o crescimento em meio de auto-indução e uma temperatura de incubação de 25ºC, uma vez que obtivemos uma fração solúvel com maior quantidade de proteína e consequentemente uma maior quantidade da proteína de interesse. No entanto, não se obteve a rNec com a massa molecular esperada de 110kDa, mas sim várias versões truncadas com massas moleculares entre os 25 e 75 kDa. Relativamente à purificação da rNec, a utilização de 50 mM Tris e 500 mM NaCl (pH 7.4) nos tampões de ligação e eluição e de um gradiente de eluição linear até atingir 300 mM de imidazole, permitiu obter uma fração enriquecida em rNec (rendimento final de cerca de 1.2 mg/L), embora com alguma co-eluição de proteínas de E. coli. Esta fração de purificação foi de seguida avaliada relativamente às suas propriedades adesivas utilizando várias técnicas, concluindo-se que possuí propriedades de adsorção similares ao Fibrinogénio (precursor da fibrina) em superfícies hidrofóbicas e hidrofílicas, mas com um desempenho superior em superfície carregadas negativamente. O filme proteico obtido com fração de purificação com rNec, tem uma topografia semelhante à observada anteriormente para o adesivo secretado pelo ouriço do mar P. lividus, sendo constituída por nanoestruturas globulares, e quando testado em solução produz forças adesivas superiores às anteriormente registadas para o adesivo secretado por P. lividus e curvas de força distância com uma aparência de serrilha (característico dos bioadesivos marinhos) e que é indicativo de abundância de folhas ß na sua estrutura. A multiplicidade e complementaridade das técnicas utilizadas permitiu obter com sucesso a primeira proteína adesiva recombinante inspirada em ouriços do mar, em quantidades suficientes, para avaliar as suas propriedades adesivas, dando assim mais um passo para o desenvolvimento de adesivos biomiméticos para futuras aplicações biomédicas ou industriais.Sea urchins Paracentrotus lividus have specialized adhesive organs, the tube foot, which produce adhesive and deadhesive secretions to attach strongly but reversibly to the substrate. This bioadhesive, unlike synthetic adhesives, is resistant and effective in the presence of water and adheres to various natural and man-made surfaces. It has lower adhesive forces than synthetic adhesives, but higher adhesive forces than biological adhesives, such as fibrin which is currently used as a surgical adhesive. Therefore, sea urchin-inspired bioadhesives may find future applications in the biomedical field. However, the amount of secreted adhesive is minute, and therefore extraction and purification of adhesives proteins directly from tissues or secretions is incompatible with a practical application. For this reason, in this study, we produced a recombinant protein, inspired by the adhesive protein Nectin. This protein has a known full sequence and has been shown to be highly overexpressed in P. lividus tube feet discs, being also secreted into the adhesive. These are strong indications that Nectin is most likely involved in sea urchin adhesion. In the present study, we used heterologous production of Nectin (rNec) in Eschirichia coli, optimizing its expression using a synthetic gene and testing various growth media and conditions, followed by optimization of cell lysis and protein purification by Immobilized Ion Affinity Chromatography (IMAC) and characterization by SDS-PAGE and Western Blotting. The adhesive properties of rNec were tested on various surfaces and evaluated by various complementary techniques, such as Surface Coating Tests, Goniometry, Ellipsometry, Surface Plasma Resonance (SPR) and Atomic Force Microscopy (AFM). The obtained results show that among the tested conditions, the best way to produce rNec with the pHTP1 vector in E. coli BL21, is to grow the bacteria in self-inducing medium with an incubation temperature of 25ºC, since we obtained a soluble fraction with a high protein concentration and consequently a greater amount of the protein of interest. However, rNec wasn’t obtained with the expected molecular mass of 110 kDa, but rather several truncated versions with molecular masses between 25 and 75 kDa. For the purification of rNec, the best results were obtained using 50 mM Tris and 500 mM NaCl (pH 7.4) in the binding and elution buffers, conjugated with a linear elution gradient up to 300 mM of imidazol. This resulted in a rNec enriched fraction (final yield about 1.2 mg/L), although with some co-elution of E. coli proteins. This purification fraction was then evaluated for its adhesive properties using various techniques, showing that rNec has absorption properties similar to Fibrinogen (fibrin precursor) on hydrophobic and hydrophilic surfaces, but overperforms on negatively charged surfaces. In terms of topography, rNec film is composed by globular nanostructures similar to P. lividus secreted adhesive. In addition, when tested in solution rNec produces higher adhesive forces than previously recorded for P. lividus secreted adhesive and shows force-distance curves with a characteristic saw-tooth appearance (typical of marine bioadhesives) indicative of a β-sheet rich structure. The multiplicity and complementarity of the techniques used, allowed the successful production of the first sea urchin inspired recombinant adhesive protein, in sufficient amounts, to evaluate its adhesive properties, thus taking another step towards the development of biomimetic adhesives for future biomedical or industrial applications.Santos, Romana Lopes AlmeidaViana, Ana Maria V. S.Repositório da Universidade de LisboaBatista, Joana Domingues Leal2021-12-31T01:30:11Z202020192020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/42074TID:202482227porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-11-20T17:56:32Zoai:repositorio.ul.pt:10451/42074Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openairemluisa.alvim@gmail.comopendoar:71602024-11-20T17:56:32Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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