Characterization of CFTR nonsense mutations using novel CFTR minigenes

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Amorim, João Pedro Pacheco Conde de
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/10362
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013
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spelling Characterization of CFTR nonsense mutations using novel CFTR minigenesFibrose quísticaCFTRPTCMutações nonsense próximas de AUGResistência a NMDTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013A Fibrose Quística (FQ) é a doença recessiva autossómica letal mais comum na população caucasiana e apresenta, na Europa, uma taxa de incidência de 1 em 3500 recém nascidos, enquanto que em Portugal, 1 em cada 6000 novos nados-vivos apresenta a doença. A doença é causada por mutações no gene CFTR (do inglês Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) que levam à formação de uma pro-teína (com o mesmo nome) com função anormal ou reduzida ou até à completa inibição da expressão da mesma). A CFTR exerce a sua função de canal de cloreto e de outros aniões na membrana apical de células epiteliais de vários tecidos. Do ponto de vista clínico, a FQ é caracterizada por um rápido declínio da função pulmonar devido à obstrução das vias respiratórias causada por infeções bacterianas recorrentes e persistentes. Devido ao ambiente hiper-inflamatório provocado por estas infeções, a remodelação do tecido pulmonar ocorre a um ritmo aumentado, que culmina na formação de fibrose no tecido e na consequente perda de função. Este fenótipo pulmonar é o principal responsável pela morbilidade e mortalidade dos doentes com FQ. Para além do tecido pulmonar, outros órgãos e tecidos são igualmente afetados, sendo que os pacientes apresentam frequentemente problemas digestivos graves e são geralmente inférteis (todos os homens e uma grande percentagem das mulheres). Até à data, foram identificadas mais 1900 alterações no gene CFTR sendo a maioria causadora de doença, sendo a deleção do resíduo de fenilalanina na posição 508 da cadeia peptídica a mais comum das detetadas em pacientes e portadores (~90% de todos os casos). Mutações nonsense levam, na maioria dos casos, à degradação total ou quase total dos transcritos de CFTR, ao desencadearem o mecanismo de degradação do mRNA denominado NMD (do inglês Nonsense-Mediated mRNA De-cay). Estudos recentes, realizados com gene que codifica para a β-globina, demonstraram que a presença de codões stop prematuros em proximidade com o codão de início da tradução não desencadeiam a degradação dos transcritos uma vez que não levam à ativação de NMD. No entanto persiste a dúvida se tal sucederá em genes bastante maiores como é o caso do gene CFTR. O principal objetivo deste trabalho passou, portanto, por uma maior compreensão do mecanismo de degradação NMD, no contexto de genes de grandes dimensões, usando como modelo o gene CFTR. Mais concretamente, pretendeu-se caracterizar várias mutações nonsense, previamente detetadas em doentes com FQ e/ou portadores, localizadas em proximidade com o codão AUG (Q2X, S4X e Q39X), usando minigenes de CFTR gerados através de engenharia genética, bem como validar esse modelo para o estudo de NMD, ao induzir este mesmo mecanismo com a mutação G542X, tal como haveria sido reportado em estudos prévios. Pretendeu-se ainda testar capacidade de vários fármacos em induzir o read-through das várias mutações nonsense. Foram gerados vários plasmídeos codificando minigenes de CFTR, contendo intrões normais e artificialmente construídos, com as várias mutações estudadas e em seguida estabelecido um modelo de expressão estável e isogénica desses mesmos minigenes em células HEK 293. Através de RT-PCR foi demonstrado que a presença da mutação G542X na sequência do minigene de CFTR levou à ativação de NMD e consequente degradação dos transcritos de CFTR, enquanto os transcritos dos variantes com mutações próximas do codão de iniciação não foram degradados. Foi observada, a partir da análise por imunodeteção, a ocorrência da reiniciação da tradução da CFTR nos variantes resistentes à degradação por NMD, e que proteína produzida, apesar de não possuir a região N-terminal era capaz de migrar para a membrana celular. Ensaios de efluxo de iodeto indicaram que a proteína truncada apresentava atividade reduzida e retardada. Não foram no entanto bem-sucedidas as tentativas de promover através de fármacos o read-through dos codões de stop prematuros em nenhum dos variantes.Cystic Fibrosis is the most common lethal autosomic recessive disorder in the Caucasian population, affecting 1 in 6000 newborns in Portugal, and is caused by mutations in the CFTR gene which encodes for the CFTR protein. Since its recognition, more than 1900 CFTR mutations have been identified, being the deletion of a phenylalanine at position 508 the most prevalent of all. Most nonsense mutations lead to complete loss of protein expression due to transcript quick degradation via NMD pathway. However recent studies of the β-globin gene showed some nonsense variants with AUG-proximal PTCs are resistant to this degradation mechanism. The principle aims of this study were to generate and validate a CFTR minigene model that could be used for the study of NMD in the context of CFTR, a far larger gene than β-globin (~190kb vs ~4 kb), to characterize, using said model, naturally occurring AUG-proximal CFTR nonsense mutations, and test the efficacy several pharmacological read-through promoting agents. CFTR plasmid minigenes containing normal and artificially constructed introns as well as several naturally occurring nonsense mutations (Q2X, S4X, Q39X and G542X) were generated and a model for stable and isogenic expression of these minigenes in HEK 293 cells established. By RT-PCR analysis we showed that the presence of the mutation G542X, was at the minigene sequence was able to activate NMD, while CFTR transcripts with AUG-proximal nonsense mutations were not degraded. It was shown by western blot essays that AUG-proximal nonsense variants expressed a truncated form of CFTR lacking the N-terminus region which probably resulted from the occurrence of translation re-initiation. Residual levels of this truncated form of CFTR were also detected at the cytoplasmic membrane and iodide efflux essays indicated that it possessed reduced and delayed channel function. However, attempts of pharmacologically promote PTC read-through in any nonsense variant were deemed unsuccessful.Ramalho, Anabela S.Amaral, Margarida, 1958-Repositório da Universidade de LisboaAmorim, João Pedro Pacheco Conde de2014-01-30T12:43:52Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/10362TID:201337606enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:55:48Zoai:repositorio.ul.pt:10451/10362Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:34:25.055938Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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