Study and characterization of CFTR mutations in vitro and in native tissues from non CF patients with chronic airways diseases
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| Data de Publicação: | 2017 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/30378 |
Resumo: | Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017 |
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Study and characterization of CFTR mutations in vitro and in native tissues from non CF patients with chronic airways diseasesFibrose quísticaMutaçõesSplicingCFTRDoenças respiratóriasTeses de mestrado - 2017Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Cystic Fibrosis (CF) is the most common autosomal recessive disorder among Caucasians caused by mutations in the CF Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene, which encodes a protein localized in the apical plasma membrane (PM) of epithelial cells that functions as a chloride (Cl-) and bicarbonate (HCO3-) channel. Previous studies have shown the occurrence of at least one CFTR mutation also in non-CF patients with asthma, chronic bronchiectasis and chronic obstruction pulmonary disease (COPD) with unknown etiopathology. Until now about 2,000 CFTR variations have been found, in which 11% of them are known to be splicing mutations. A novel antisense oligonucleotide (AON) therapy approach corrects splicing defects and is giving some hope for patients carrying this type of mutations. The objective of the current MSc project was two-fold, namely: 1) To investigate the possible involvement of the 9 most common Portuguese CFTR mutations in causing non-CF respiratory disorders: asthma, COPD and chronic bronchiectasis. 2) To characterize the impact of four splicing mutations located in the same splicing consensus-711+1G>T, 711+3A>T, 711+3A>G and 711+5G>A and correct them using a single AON. Our results showed that at least 3 mutations out of 9 most common Portuguese CFTR mutations were found in our cohort of patients with respiratory disorders. Concerning the study of splicing mutations, in vitro experiments were performed using a reporter splicing minigene. We showed that all four splicing mutations located in the same splicing consensus one IVS5 caused skipping of exon 5, which produce a smaller protein and lead to a mislocalization of the CFTR protein in the PM. In addition, the same AON potentially corrected all four splicing mutations. Altogether these data suggest that there is an involvement of some CFTR mutations commonly found in Portugal in causing non-CF chronic airway diseases and that patients carrying the splicing mutations studied here can benefit from the same AON for therapy.A fibrose quística (FQ) é a doença autossómica recessiva mais comum na população Caucasiana, afetando 1 em cada 6000 portugueses. Esta doença afeta vários órgãos e os doentes apresentam variados sintomas, os mais comuns sendo: elevadas concentrações de cloreto no suor, infeções bacterianas recorrentes devido ao muco espesso formado nos pulmões e malnutrição. A FQ é causada por mutações no gene da CFTR (do inglês Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) que codifica uma glicoproteína localizada na membrana apical de células epiteliais e funciona como um canal de cloreto (Cl-) e bicarbonato (HCO3-). Tradicionalmente, o diagnóstico da FQ baseia-se nas manifestações clínicas, história familiar e dois testes de suor positivos (>60mM), porém quando esta abordagem é inconclusiva, são feitos testes genéticos para identificar mutações nos dois alelos e medições de corrente para verificar a função ou disfunção da CFTR. Estudos prévios reportaram uma parcial disfunção da proteína CFTR em doentes sem nenhuma manifestação clínica de FQ, mas com outras doenças como pancreatite, asma, bronquiectasias crónicas e doenças pulmonares de obstrução crónica (DPCO), de origem desconhecida, sugerindo uma associação entre mutações no gene da CFTR e outras doenças que não sejam FQ. Adicionalmente, foi demonstrado que alguns desses indivíduos possuíam apenas uma mutação no gene da CFTR. Contudo, as mutações encontradas são raras e portanto não incluídas entre as mutações mais frequentes encontradas em Portugal. Além disso nem todas as variantes na CFTR estão descritas como causadoras de FQ. Atualmente são conhecidas mais de 2.000 variações no gene da CFTR, e apenas aproximadamente 250 mutações estão descritas como sendo causadoras de FQ. Estas mutações são classificadas de acordo com o defeito causado na proteína e estão agrupadas em sete classes (I-VII). As mutações de splicing pertencem à classe V (mutações que diminuem os níveis da proteína na membrana apical) e compreendem uma fração de 11% das variações conhecidas no gene da CFTR. Estas mutações resultam num splicing anormal destruindo as junções normais dos RNAs ou criando um novo local de splicing no interior de um intrão ou de um exão. Tais alterações levam à produção de uma proteína disfuncional ou truncada o que diminui os níveis da proteína normal que é expressa. É previsível que a percentagem de mutações de splicing sejam superiores a 11%, devido às mutações missense, que não estão totalmente caracterizadas e que também podem levar a um splicing anormal. Os doentes que possuem esta classe de mutações podem beneficiar apenas de um fármaco que potencia a função da proteína resultante de transcritos normais, o Ivacaftor (VX770). Porém, como algumas mutações de splicing diminuem drasticamente os níveis de proteína funcional, potenciar a proteína não é suficiente, sendo necessário corrigi-la. Para este efeito uma nova abordagem tem sido adotada nomeadamente, o uso de terapias de RNA que corrigem o defeito a nível do RNA mensageiro (mRNA). Uma dessas terapias é o uso de AONs (do inglês antissense oligonucleotides), que bloqueiam ou aumentam o processo de splicing, de acordo com a sequência a que se ligarão. No presente trabalho de Mestrado tivemos dois objetivos principais, nomeadamente: 1) Investigar o envolvimento das nove mutações do gene da CFTR mais comuns entre os Portugueses no desenvolvimento de doenças respiratórias, tais como asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) e bronquiectasias. 2) Caracterizar o impacto de quatro mutações -711+1G>T, 711+3A>T, 711+3A>G e 711+5G>A localizadas na mesma sequência de consensus do intrão 5 e finalmente corrigi-las usando um único AON desenhado no nosso laboratório. Para o primeiro objetivo, foi extraído DNA genómico de amostras de sangue dos indivíduos em estudo e, com técnicas de PCR (do inglês polymerase chain reaction) modificado, foram procuradas as nove mutações no gene da CFTR mais comuns para pacientes FQ portugueses. Os resultados mostram que três das nove mutações mais comuns foram encontradas em pacientes com doenças respiratórias, onde a mutação mais comum foi a F508del, a mais comum na população mundial. Adicionalmente constatou-se que a G576A, descrita como sendo um polimorfismo, também parece estar envolvida na suscetibilidade de aparecimento de doenças respiratórias mesmo quando presente individualmente, sem que o outro alelo do indivíduo esteja mutado, porém este polimorfismo não foi encontrado entre a população FQ. Estes resultados sugerem que os polimorfismos no gene da CFTR podem estar envolvidas no aparecimento de asma, bronchiectasias e DPCO, e ainda que mutações num só alelo deste gene podem aumentar a suscetibilidade de um indivíduo portador desenvolver doenças respiratórias, sem que haja manifestação clínica típica de FQ. Para o 2º objetivo, utilizámos um mini-gene de CFTR consistindo num construto de cDNA de wt-CFTR previamente clonado no plasmídeo pcDNA5, contendo dois intrões: o intrão quatro (IVS4) e o intrão cinco (IVS5) entre os exões 4 e 5 e os exões 5 e 6a, respetivamente, e dois marcadores (eGFP em N-terminal e Flag-tag no 4º loop extracelular) . Introduzimos cada uma das mutações de splicing em estudo por mutagénese direcionada neste mini-gene repórter. De seguida, cada um dos construtos foi clonado num vetor lentiviral para a produção de novas linhas celulares (experiência por concluir para comparação de resultados). Toda a caracterização apresentada ao longo deste trabalho, foi feita em células que expressavam cada um dos construtos por transfeção transitória. O impacto de cada mutação expressa pelas células foi caracterizado a nível do mRNA, expressão e localização da proteína na membrana. Resultados de PCR quantitativo (qPCR) e semi-quantitativo revelaram que as quatro mutações provocam a remoção total do exão cinco e que a mutações 711+1G>T e 711+5G>A diminuem drasticamente os níveis de transcritos normais, mais do que as mutações 711+3A> G e 711+3A>T. Com a técnica de Western blot (WB) verificou-se que a proteína resultante dos construtos com as mutações 711+1G>T, 711+3A>T, 711+3A>G e 711+5G>A é menor do que a proteína normal. Para além disso, quando caracterizadas por imunofluorescência, notou-se uma redução drástica dessas proteínas na membrana plasmática (PM), sugerindo um défice no processamento e possivelmente no tráfego da mesma. Na tentativa de corrigir todas as quatro mutações com o mesmo AON, este foi desenhado à distância de 20 bases a jusante do primeiro nucleótido do intrão 5, e verificou-se que um único AON aumentou o nível de transcritos normais produzidos e a expressão da proteína na PM. Na sua globalidade, os resultados obtidos ao longo deste trabalho indicam que as mutações no gene da CFTR mais comuns encontradas entre portugueses poderão estar envolvidas no desenvolvimento de doenças respiratórias sem que haja manifestação clínica de FQ, e ainda que um único AON pode beneficiar pacientes com pelo menos uma das mutações estudadas. Estudos futuros, expandindo a lista das mutações no gene da CFTR de pacientes com doenças respiratórias são importantes para potenciar e comprovar a associação entre a proteína CFTR e essas doenças. Além disso a determinação do genótipo e a caracterização do efeito das mutações ajudará a relacionar o genótipo com o fenótipo, melhorando assim o prognóstico tanto de pacientes com FQ como também a avaliação da suscetibilidade de um indivíduo portador desenvolver outras doenças respiratórias. A correção das mutações de splicing em estudo por este AON precisa ainda de ser avaliada em sistemas celulares derivados de materiais de doentes ex vivo para tornar os resultados mais robustos e fisiologicamente relevantes. Com efeito são já extremamente encorajadores e comprovar em materias de pacientes a eficácia dum mesmo AON para corrigir 4 mutações de splicing diferentes, aumentará a sua potencialidade para uso futuro in vivo em pacientes com pelo menos uma destas mutações de splicing.Amaral, Margarida, 1958-Repositório da Universidade de LisboaMassinga, Arsénia Joana2018-01-10T16:51:58Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/30378TID:201865270enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:23:14Zoai:repositorio.ul.pt:10451/30378Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:46:09.078011Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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