Evaluating the impact of 2D, 3D static and 3D microfluidic tissue culture conditions on the in vitro response of cancer cells to chemotherapeutic agents

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Almeida, Mariana Gaspar de
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/51708
Resumo: Tese de Mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Evaluating the impact of 2D, 3D static and 3D microfluidic tissue culture conditions on the in vitro response of cancer cells to chemotherapeutic agentsCultura celular 2DCultura celular 3DEsferóidesViabilidade celular e expressão génicaTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de Mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasApesar da evolução exponencial no campo da investigação médica e biomédica, o cancro continua a ser uma das principais causas de morte no mundo. É a sexta principal causa de morte no mundo com cerca de dez milhões de pessoas a morrerem por ano devido ao tratamento ineficiente desta doença. Um dos principais problemas da comunidade científica na descoberta de tratamentos mais eficazes e personalizados para cada paciente é a inexistência de modelos in vitro que sejam capazes de representar a complexidade de um tumor in vivo. Desta forma, é de extrema importância o contínuo esforço da comunidade científica na descoberta e desenvolvimento de modelos in vitro que representem cada vez melhor a complexidade dos processos biológicos presentes nos tumores humanos. Em investigação científica, o método mais comum de cultura de células é o de duas dimensões (2D), que possibilita o estudo de mecanismos biológicos associados a doenças, bem como o teste de possíveis alvos e tratamentos. Este método baseia-se na utilização de frascos ou placas de petri de plástico como suporte para o crescimento de linhas celulares tumorais. As células são adicionadas ao frasco e é lhes adicionado o meio adequado com a respetiva suplementação de modo que estas consigam obter todos os nutrientes necessários à sua sobrevivência e duplicação. O meio é metabolizado pelas células e posteriormente removido e substituído por meio novo, para que as células possam continuar a crescer e a multiplicar-se. Assim, ao invés do que acontece no organismo humano com a presença do sistema circulatório, as células têm à sua disposição, de forma controlada, todos os nutrientes necessários à sua sobrevivência e a remoção dos produtos finais provenientes do metabolismo celular depende do operador. Assim, o método 2D representa uma forma bastante simples e com baixo custo de manter as células em cultura, motivo pelo qual é um dos mais utilizados em investigação científica. Desta forma, a cultura de células em 2D teve um impacto colossal na descoberta de muitos dos processos biológicos que conhecemos hoje em dia, essenciais para o desenvolvimento de terapias e tratamentos para variadas doenças. No entanto, a identificação e investigação de possíveis alvos quimioterapeuticos utilizando apenas este tipo de cultura celular apresenta uma taxa de reprovação de novos fármacos de cerca de 90%. Tal facto deve-se em parte à ausência de propriedades essenciais nos tumores in vivo como, organização tridimensional das células, as interações célula-célula, sinais bioquímicos e a presença de componentes essenciais do microambiente do tumor, que levam à exagerada simplificação dos mecanismos observados em tumores humanos. Desta forma, as células que crescem usando este método não irão responder de forma semelhante aos tumores presentes no organismo humano aquando da presença de agentes quimioterapeuticos, levando ao aumento da taxa de reprovação destes agentes. A organização estrutural tridimensional presente nos tumores humanos é essencial para a organização, diferenciação e proliferação das células que compõem o tumor. Apesar da grande utilização de linhas celulares tumorais em conjunto com métodos 2D, células derivadas de tumores de pacientes (PDCs) e xenoenxertos de pacientes (PDXs) são exemplos de métodos usados numa tentativa de maior aproximação com a realidade dos tumores in vivo. No entanto, estes modelos ainda apresentam grandes falhas na representação das características estruturais dos tumores. Assim, foram desenvolvidos modelos tridimensionais (3D) que consistem na formação de esferóides ou organoides, agregados celulares, usando dois tipos de métodos de formação: com ou sem um esqueleto artificial ou natural a envolver as células. Este tipo de modelo representa melhor o ambiente tridimensional do tumor, uma vez que permite a interação celular causada pela agregação das células na formação da estrutura tridimensional e pode permitir a interação com um esqueleto que mimetiza a matriz extracelular (ECM) presente in vivo. A interação entre células cancerígenas e a ECM e outros componentes como fatores de crescimento e proteínas é essencial para a determinação da progressão tumoral e sobrevivência do tumor in vivo. Desta forma, é fundamental que a eficácia dos agentes quimioterapeuticos seja testada em modelos que sejam capazes de descrever estas interações e características de modo que o efeito detetado nos ensaios in vitro seja o mais parecido com o observado no paciente. Uma das principais vantagens do uso de esferóides para o desenvolvimento de novas terapias é o facto deste tipo de estruturas apresentarem uma estrutura tridimensional em camadas, estando presentes células em proliferação na camada mais externa e células em senescência e necrose à medida que nos aproximamos do seu interior. Assim, a presença de células em diferentes estados do ciclo celular tem como consequência uma diferença na eficácia do tratamento em cada parte da estrutura tridimensional. Desta forma, os esferóides são capazes de mimetizar a heterogeneidade e mecanismos de resistência aos tratamentos in vitro. No entanto, apesar da grande evolução dos modelos in vitro, estas estruturas 3D ainda não representam na totalidade as características de um tumor no organismo humano. Assim, os dispositivos microfluídicos são uma das áreas de maior desenvolvimento de modelos in vitro para a testagem de novos tratamentos tumorais. Baseiam-se na adição aos modelos 3D de características como a perfusão de nutrientes e remoção de produtos do metabolismo celular e da pressão associada a este mecanismo. Este tipo de dispositivos permite a reprodução das funções do sistema circulatório do organismo humano in vitro, tendo a possibilidade de controlar a velocidade do fluxo de nutrientes e de remoção de produtos do metabolismo. Para além destas vantagens, possibilita também o estudo em tempo real dos esferóides com a análise do fluxo que sai destes dispositivos depois de passar pelas células, permitindo o desenvolvimento de terapias personalizadas em tempo real. No entanto, os sistemas microfluídicos ainda estão em desenvolvimento dada a sua complexidade e fácil perturbação com pequenos detalhes como a presença de bolhas de ar na câmara onde se localiza o esferóide. Neste trabalho, pretendeu-se contribuir para a abordagem desta problemática com foco na utilização de duas linhas celulares, HCT-116 e U87 MG, de cancro colorectal e de glioblastoma, respetivamente. O cancro colorectal é o terceiro mais frequente no mundo, com quase 700 mil mortes por anos, e o glioblastoma é um dos tumores cerebrais mais agressivos do sistema nervoso central, necessitando ambos de terapias mais eficazes no seu tratamento. Assim, este estudo teve como objetivo comparar três métodos de cultura celular diferentes: 2D, esferóides e um sistema microfluídico, de forma a identificar diferenças na resposta celular a dois medicamentos quimioterapeuticos, 5-FU e TMZ utilizados no tratamento de cancro colorectal e glioblastoma, respetivamente. De forma a atingir este objetivo, as células cultivadas nos diferentes métodos foram avaliadas em termos de viabilidade celular, expressão génica, proliferação celular e organização tridimensional. Em termos de viabilidade celular, as duas linhas celulares apresentaram comportamentos diferentes, tendo a linha celular HCT-116 demonstrado que as células cultivadas em 2D apresentam uma viabilidade menor do que as 3D aquando do tratamento com 5-FU, enquanto a linha celular U87 MG não apresentou uma diferença significativa entre os dois métodos de cultura. Desta forma, parece que a elevada heterogeneidade característica de células de glioblastoma pode ter causado a ativação de mecanismos de seleção de clones resistentes ao tratamento, demonstrando assim um menor impacto do tratamento, independente do tipo de método de cultura utilizado. Relativamente à expressão génica, os resultados sugerem que o aumento da expressão de GADD45A e CDKN1A podem estar relacionamos com a resistência das células ao tratamento e, por isso, com uma maior viabilidade celular. A expressão génica do c-Myc sugere que o seu aumento pode estar relacionado com a baixa presença de oxigénio, permitindo a ativação de um mecanismo de resistência aos tratamentos, no entanto os resultados não foram consistentes, sendo necessário uma análise posterior mais detalhada. Em termos de organização espacial, os esferóides HCT-116 formados apresentavam uma camada externa proliferativa bem definida que foi afetada pelo tratamento, ao invés dos esferóides U87 MG, em que esta camada não se mostrou tão evidente e na qual o tratamento não mostrou ter impacto. Em suma, este trabalho é uma contribuição para a identificação das principais diferenças, em termos de viabilidade celular, expressão génica e organização tridimensional, do método tradicional 2D e do método 3D utilizando esferóides na resposta a fármacos quimioterapeuticos. No entanto, apesar da necessidade de uma análise mais detalhada, os resultados parecem sugerir que a resposta celular a agentes quimioterapeuticos pode ser influenciada pelo método de cultura in vitro utilizado.Cancer is still a huge worldwide problem, and many cancer types still lack effective therapy. One of the major challenges in cancer and medical research is the transfer of knowledge from the wet lab to patient’s treatment. This is partly due to the fact that in vitro cell culture models are still in need of development in order to better mimic the structural characteristics of human solid tumours and their interactions with the surrounding environment. This study aimed to compare the tumour cell’s response to chemotherapeutic agents under three different culture conditions by assessing cell viability, gene expression, cellular proliferation, and structural arrangement. For this purpose, two cell lines were used, HCT-116 and U87 MG, one from colorectal cancer and the other from glioblastoma, respectively. The results showed that both cell lines have different behaviours. Indeed, while HCT-116 had higher cell viability in the 3D than in the 2D culture model upon 5-FU treatment, the U87 MG cell line had almost no difference between the two models, with a tendency of the 2D having higher viability. The results from GADD45A and CDKN1A gene expression followed a similar behaviour of the cellular viability, therefore a higher cellular viability may eventually be associated with a higher expression of these genes, and thus be related to possible resistance mechanisms. The spheroids formed by both cell lines presented good integrity and a typical 3D layered structure. Upon chemotherapeutic drug treatment, the HCT-116 spheroids showed a big impact in the size and distribution of the proliferative cells within the spheroid, however the U87 MG spheroids showed less evidence of TMZ treatment impact. In conclusion, this work gives important information about the molecular and structural differences between cells cultured in 2D and 3D cell culture conditions, which are therefore relevant for the development of drug screening methods.Carvalho, Margarida Henriques da GamaRepositório da Universidade de LisboaAlmeida, Mariana Gaspar de2022-03-11T17:24:16Z202120212021-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/51708TID:202994619enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:56:35Zoai:repositorio.ul.pt:10451/51708Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:02:57.762289Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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