ΔNp63 critical for progression of high grade non-muscle invasive bladder cancer through deregulation of specific genetic pathways
| Autor(a) principal: | |
|---|---|
| Data de Publicação: | 2017 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/31995 |
Resumo: | Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017 |
| id |
RCAP_401304fc2d8dce9a6a9c0412bcbc7bf3 |
|---|---|
| oai_identifier_str |
oai:repositorio.ul.pt:10451/31995 |
| network_acronym_str |
RCAP |
| network_name_str |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| repository_id_str |
7160 |
| spelling |
ΔNp63 critical for progression of high grade non-muscle invasive bladder cancer through deregulation of specific genetic pathwaysCancroBexigaNMIBCΔNp63AGR2Teses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017Cancro da bexiga é o nono tumor mais comum a nível mundial, com uma estimativa de 429 000 novos casos registados, em 2012, e aproximadamente 165 000 mortes registadas, nesse mesmo ano, em todo o mundo. Os parâmetros clínicos e patológicos usados para avaliar o estádio do cancro da bexiga têm elevadas limitações e até à data ainda não existe nenhum biomarcador que preveja o comportamento tumoral em cada paciente. Por este motivo, é essencial a identificação de novos biomarcadores que estejam envolvidos na progressão tumoral e que permitam reconhecer diferentes tumores de acordo com a sua capacidade progressiva e invasiva. A classificação dos diferentes subtipos de tumor da bexiga permitirá desenvolver um tratamento especializado e individualizado, o que possibilitará uma melhoria da qualidade de vida e da taxa de sobrevivência destes doentes. O gene TP63 pertence à família do supressor de tumor TP53. No entanto ao contrário do TP53, que se encontra mutado em grande parte dos tumores, o gene TP63 raramente está na sua forma mutada. Ainda assim, a expressão do gene TP63 está alterada em alguns tumores. A isoforma do gene TP63, designada por ΔNp63, tem sido estudada como um possível biomarcador na área da oncologia, pois existem evidências que a relacionam com a progressão do tumor da bexiga não invasivo da camada muscular (NMIBC) para um tumor invasivo da camada muscular (MIBC). Estudos sugerem que esta isoforma inibe a senescência e a apoptose celular assim como promove a tumorogénese, proliferação e sobrevivência celular, exibindo características oncogénicas. No tecido normal da bexiga, o ΔNp63 tem uma alta/elevada expressão enquanto que no tecido tumoral de bexiga esta isoforma encontra-se subregulada. Este projeto foi iniciado em Mount Sinai, Nova Iorque, pela orientadora deste trabalho, Dr.ª Mireia Castillo, onde, após inativar o gene ΔNp63 das linhas celulares de NMIBC (RT112 e BFTC), observou que estas células apresentavam maior taxa de proliferação in vitro e in vivo, maior taxa de invasão in vitro e maior incidência de tumores primários e formação de metástases in vivo. Deste modo, foi necessário validar os resultados na Fundação Champalimaud e verificou-se, através do modelo ortotópico in vivo, que as células clones (BFTC_C e RT112_C) apresentaram maior agressividade tumoral e maior formação de metástases, assim confirmando o que tinha sido observado anteriormente. Através da análise da expressão génica, observou-se ainda que ambas as linhas celulares apresentavam nove e quatro genes, respetivamente sobrerregulados e subregulados, concomitantemente nas duas linhas celulares, respetivamente. Desta forma, o segundo objetivo deste projeto consistiu em descobrir quais dos genes selecionados na análise de expressão génica seriam mais relevantes na progressão tumoral. No entanto, apenas quatro dos nove sobrerregulados (AGR2, HOXC6, HRK e S100A4) e dois dos quatro genes subregulados (SCML1 e SPOCK1) foram estudados, com base no seu relacionamento com o desenvolvimento tumoral referido na literatura e também por existirem bons anticorpos e primers específicos. Deste modo, extraiu-se RNA das quatro linhas celulares (RT112_L_C, RT112_L_P, BFTC_L_C e BFTC_L_P) para realizar ensaios quantitativos de reação em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR) de forma a validar os resultados obtidos pela análise da expressão génica. A partir das mesmas linhas celulares foi extraída proteína para realizar ensaios de western blot (WB) e ensaios de imunofluorescência (IF), estes últimos foram realizados em células fixadas. Estas técnicas permitiram quantificar os níveis de proteína em cada linha celular (BFTC_P, BFTC_C, RT112_P e RT112_C). Após comparar os níveis de RNA mensageiro (mRNA) e de proteína, AGR2 foi o gene eleito como um dos favoritos a ter um papel essencial na progressão do tumor da bexiga. AGR2 tem maior expressão de mRNA nas células clones (ΔNp63-) comparativamente com as parentais (ΔNp63+) (observado apenas na linha celular designada BFTC). Relativamente à síntese de proteína, os resultados do WB sugerem que AGR2 é produzida em maior quantidade nas células clones (ΔNp63-) do que nas parentais (ΔNp63+) (em ambas as linhas celulares) e através de IF observa-se o mesmo resultado na linha celular BFTC. Outros estudos sugerem que o gene AGR2 tem funções extracelulares que aumentam a agressividade de diferentes tumores, como por exemplo o cancro do pulmão, da mama e da próstata. Além disso, expressão de mRNA de AGR2 é elevada no carcinoma de células de transição da bexiga, adenocarcinoma da próstata e do pulmão. A desativação do gene foi feita em cinco conjuntos de células de cada linha celular de NMIBC, onde já tinha sido inativado a isoforma ΔNp63 do gene TP63, formando cinco clones de cada linha celular, designados por BFTC_A1, BFTC_A2, BFTC_A3, BFTC_A4 e BFTC_A5, assim como para a linha celular RT112. Após silenciamento do gene AGR2 por shRNA nas células BFTC_C e RT112_C, estudaram-se os níveis de mRNA por qRT-PCR, e de proteína através das técnicas de WB e IF para determinar a eficiência da eliminação do mesmo. Estes estudos só foram realizados para a linha celular BFTC. O clone BFTC_A5 mostrou ser o que apresentava menor nível de mRNA e respetiva proteína AGR2, por isso esta linha celular foi utilizada para estudos funcionais, como ensaios de ciclo celular, ensaios de proliferação e ensaios de invasão celular. Os estudos funcionais foram essenciais para observar se o gene AGR2 está envolvido na progressão celular. Ensaios de ciclo celular revelaram que as células tumorais designadas BFTC_A5 (ΔNp63- AGR2-) apresentaram menor divisão celular comparativamente às células tumorais BFTC_C (ΔNp63- AGR2+) e BFTC_P (ΔNp63+ AGR2+), in vitro. As células tumorais BFTC_A5 (ΔNp63- AGR2-) revelaram ainda menor capacidade de proliferação e de invasão celular, in vitro. Estes estudos sugerem que o gene AGR2 pode estar envolvido na progressão do tumor da bexiga não invasivo da camada muscular (NMIBC) para invasivo da camada muscular (MIBC). As células tumorais que sintetizam em simultâneo a isoforma ΔNp63 e o gene AGR2 (BFTC_P) revelaram não ter capacidades tão proliferativas e tão invasoras como as células tumorais que apenas sintetizam AGR2 (BFTC_C). No entanto quando o gene AGR2 é desligado, estas células tumorais voltam a perder a sua capacidade invasora e proliferativa, sugerindo assim que o gene AGR2 é essencial para a proliferação e invasão tumoral. Este trabalho é o primeiro que estuda a interação entre o produto do gene AGR2 e a isoforma ΔNp63 do gene TP63 na progressão do tumor da bexiga não invasivo da camada muscular. No entanto mais estudos serão necessários para confirmar esta hipótese, nomeadamente estudos com o modelo ortotópico in vivo e também a análise de imunofluorescência de microarrays de tumores (TMA) que irá validar os resultados in vitro, assim como correlacionar a expressão do AGR2 com as características do doente (prognóstico, presença de metástases, risco de progressão, entre outros). Além disso, é também necessário realizar os mesmos ensaios, descritos neste trabalho, para a linha celular RT112. Neste trabalho, AGR2 é descrito como um potencial fator de progressão de NMIBC para MIBC. O gene AGR2 é importante para o desenvolvimento do tumor e poderá ser um biomarcador com a capacidade de distinguir tumores que devem sofrer um tratamento mais ou menos invasivo. Como por exemplo, pacientes com tumores de elevado risco de progressão poderão beneficiar de uma cistectomia, enquanto que pacientes com tumores de baixo risco de progressão poderão usufruir de um tratamento menos invasivo e de vigilância médica com alguma regularidade. A existência de um anticorpo contra a proteína AGR2 pode permitir o desenvolvimento de ensaios clínicos em doentes com NMIBC, de modo a testar a sua efetividade no controlo da progressão destes mesmos tumores.ΔNp63, an isoform of TP63 gene, has been described as an essential marker for Non-Muscle Invasive Bladder Cancer (NMIBC) progression. After knocking down ΔNp63 in NMIBC cell lines, nine and four genes were found up-regulated and down-regulated, respectively, through gene expression analysis, in two different bladder tumor cell lines (RT112 and BFTC). From this set of genes, four up-regulated (AGR2, HOXC6, HRK and S100A4) and two down-regulated genes (SCML1 and SPOCK1) were chosen for further analysis due to the availability of good antibodies and primers, in order to discover which of those genes are more relevant to bladder cancer progression. With this purpose, total RNA was extracted from BFTC and RT112 cells (both parental and knock down for ΔNp63) to perform quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and to validate the gene expression analysis. From the same cell lines, proteins were extracted to performed western blot (WB) analysis and immunofluorescence (IF) assays and the protein and RNA levels were compared. The obtained results suggest that AGR2 gene was the most related in bladder cancer progression. In addition, mRNA level of AGR2 was higher in knock down clones than in parental cells (verified only in BFTC cells) and WB results showed that AGR2 protein was also higher in knock down than in parental cells. Similar results were observed by IF assay in BFTC cells. Other studies suggested that AGR2 has extracellular functions that increase aggressiveness of different tumors. Moreover, AGR2 mRNA expression has been described as high in urinary bladder transitional cell carcinoma, prostate adenocarcinoma and lung carcinoma. To study the effects of that gene in bladder tumor progression, AGR2 was knocked down in RT112_C and BFTC_C cells which had already been knocked down for ΔNp63 and mRNA and protein level studies were performed again through qRT-PCR, WB and IF techniques. After selection of the cell line with lower level of mRNA and protein AGR2, BFTC_A5, functional studies were performed, such as cell cycle, invasion and proliferation assays. Functional studies showed that BFTC_A5 (ΔNp63- AGR2-) cells displayed lower cell division, lower proliferative and invasive capacities compared with BFTC_C (ΔNp63- AGR2+), which suggest that AGR2 may has a role in bladder tumor progression.Castillo-Martin, MireiaZilhão, Rita,1959-Repositório da Universidade de LisboaMaia, Andreia Filipa Garrido2019-12-30T01:30:12Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/31995TID:201878852enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:25:55Zoai:repositorio.ul.pt:10451/31995Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:47:20.113373Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
| dc.title.none.fl_str_mv |
ΔNp63 critical for progression of high grade non-muscle invasive bladder cancer through deregulation of specific genetic pathways |
| title |
ΔNp63 critical for progression of high grade non-muscle invasive bladder cancer through deregulation of specific genetic pathways |
| spellingShingle |
ΔNp63 critical for progression of high grade non-muscle invasive bladder cancer through deregulation of specific genetic pathways Maia, Andreia Filipa Garrido Cancro Bexiga NMIBC ΔNp63 AGR2 Teses de mestrado - 2017 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas |
| title_short |
ΔNp63 critical for progression of high grade non-muscle invasive bladder cancer through deregulation of specific genetic pathways |
| title_full |
ΔNp63 critical for progression of high grade non-muscle invasive bladder cancer through deregulation of specific genetic pathways |
| title_fullStr |
ΔNp63 critical for progression of high grade non-muscle invasive bladder cancer through deregulation of specific genetic pathways |
| title_full_unstemmed |
ΔNp63 critical for progression of high grade non-muscle invasive bladder cancer through deregulation of specific genetic pathways |
| title_sort |
ΔNp63 critical for progression of high grade non-muscle invasive bladder cancer through deregulation of specific genetic pathways |
| author |
Maia, Andreia Filipa Garrido |
| author_facet |
Maia, Andreia Filipa Garrido |
| author_role |
author |
| dc.contributor.none.fl_str_mv |
Castillo-Martin, Mireia Zilhão, Rita,1959- Repositório da Universidade de Lisboa |
| dc.contributor.author.fl_str_mv |
Maia, Andreia Filipa Garrido |
| dc.subject.por.fl_str_mv |
Cancro Bexiga NMIBC ΔNp63 AGR2 Teses de mestrado - 2017 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas |
| topic |
Cancro Bexiga NMIBC ΔNp63 AGR2 Teses de mestrado - 2017 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas |
| description |
Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017 |
| publishDate |
2017 |
| dc.date.none.fl_str_mv |
2017 2017 2017-01-01T00:00:00Z 2019-12-30T01:30:12Z |
| dc.type.status.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| dc.type.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| format |
masterThesis |
| status_str |
publishedVersion |
| dc.identifier.uri.fl_str_mv |
http://hdl.handle.net/10451/31995 TID:201878852 |
| url |
http://hdl.handle.net/10451/31995 |
| identifier_str_mv |
TID:201878852 |
| dc.language.iso.fl_str_mv |
eng |
| language |
eng |
| dc.rights.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
| eu_rights_str_mv |
openAccess |
| dc.format.none.fl_str_mv |
application/pdf |
| dc.source.none.fl_str_mv |
reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação instacron:RCAAP |
| instname_str |
Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação |
| instacron_str |
RCAAP |
| institution |
RCAAP |
| reponame_str |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| collection |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| repository.name.fl_str_mv |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação |
| repository.mail.fl_str_mv |
|
| _version_ |
1799134399652954112 |