The role of CDKs in co-transcriptional splicing through phosphorylation of the RNA Pol II carboxy-terminal domain (CTD)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cunha, Thais Souza
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/54523
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
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spelling The role of CDKs in co-transcriptional splicing through phosphorylation of the RNA Pol II carboxy-terminal domain (CTD)SplicingPol II CTDCyclin-dependent kinasesdNET-seqTeses de mestrado - 2021Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O processo de transcrição, no qual uma molécula de ácido ribonucleico (ARN) é produzido a partir de uma cadeia de ácido desoxirribonucleico complementar a ela, é caracterizado por diversas etapas em que envolvem centenas de proteínas e outros fatores constituídos por RNA. Por esse processo os genes se expressam e assim constituem os componentes celulares e teciduais formadores do organismo, além de darem origem às enzimas, elementos envolvidos nas reações necessárias ao funcionamento dos seres vivos. Ao longo do processo transcricional, o transcrito enquanto é polimerizado também passa por processamentos, os quais modificam a sequência e a constituição do mesmo. Algumas dessas edições podem ocorrer após a transcrição ser finalizada, mas o acoplamento do processamento à transcrição traz vantagens como a diminuição do tempo requerido entre um estímulo parece iniciar a expressão de um gene e o produto final dessa expressão estar pronto e disponível para executar sua função. Nesse sentido, o Domínio carboxi-terminal (do inglês CTD) da ARN polimerase II (Pol II) faz o acoplamento entre o processamento do ARN e a transcrição. O CTD assemelha se a uma cauda que se alonga a partir da maior subunidade da Pol II que não só serve de suporte aos fatores envolvidos na transcrição como também ativamente os recruta devido às modificações pós translacionais aos quais são submetidos os aminoácidos que o constituem. Esse domínio é, na verdade, composto por várias repetições da sequência Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. Sabe-se razoavelmente como esses aminoácidos e suas isoformas modificadas, geralmente fosforiladas, influenciam o processo transcricional e o processamento do ARN. No entanto, no que diz respeito ao splicing co-transcricional são poucas as informações a esse respeito. Foi reportado que a maquinaria envolvida no splicing parece estar ligada a Ser5 fosforilada quando Pol II foram imunoprecipitadas com o uso de anticorpos para essa serina e ligada as polimerases foram encontrados 5’ intermediários da primeira reação de transesterificação do splicing. Também foi reportado que em células de Drosophila, ao se fazer uso da técnica de NET-seq observou-se que a polimerase se encontrava a curta distância de onde uma região em que um intron havia sido excisado quando os investigadores fizeram uso de anti-Ser5P. Neste trabalho hipotetizamos que a Ser5 fosforilada contribui para a ocorrência de splicings ainda próximos a Pol II em elongamento. Para testar se de fato a isoforma fosforilada dessa serina desempenha esse papel, decidimos inibir as cinases responsáveis pela fosforilação das mesmas (Cinase Dependentes de Ciclinas, do inglês CDKs) a fim de averiguar se essa inibição causa uma mudança nas dinâmicas do splicing co-transcricional. Primeiramente, selecionamos inibidores farmacológicos desenvolvidos em células humanas para usarmos em células de Drosophila com o intuito de evitar a fosforilação da Ser5 do CTD. Infelizmente, nenhum dos inibidores foi capaz de impedir que a Ser5 fosse fosforilada. Provavelmente, a razão para tal foi a incapacidade dos inibidores de se ligarem ao sítio ativo das cinases. Apesar de tanto as CDKs humanas quanto as de Drosophila apresentarem considerável similaridade na sua sequência de aminoácidos, a pequena diferença de aminoácidos entre as CDKs deve ser suficiente para que os inibidores não consigam se ligar as de Drosophila. Apesar de não ser nosso objetivo, conseguimos prevenir a fosforilação específica da Ser2 em Drosophila quando da inibição da CDK12. Diante do postulado, resolvemos mudar a estratégia e escolhemos o método Auxin-Inducible Degron (AID) para depletar de forma rápida as CDKs. Com esse método adicionamos uma tag a proteína alvo, e quando for conveniente, aplicamos auxina ao meio de cultura para que a mesma possa induzir a proteína à ubiquitinação seguida da degradação da própria. Antes que isso possa ser realizado, é necessário introduzir a tag no local devido dentro do genoma de Drosophila. Para tanto, selecionamos um protocolo desenvolvido para adição de sequências na porção N-terminal de genes de Drosophila utilizando a ferramenta CRISPR/Cas9. Essa técnica faz uso da extensão sobreposta de primers para produzir um guia curto de 19 nucleotídeos com a sequência correspondente ao local onde se deve criar uma quebra dupla no ADN, e um constructo formado de braços de homologia que flanqueiam a AID tag para servir de molde para o reparo por recombinação homóloga (RH). Em nossa primeira tentativa, apesar de termos conseguido produzir os guias e os constructos de RH para todas as três cinases transcricionais que queremos depletar, CDK7, CDK9 e CDK12, não obtivemos sucesso ao transfectar nossas células. Nos constructos também está incluída uma sequência que promove resistência ao antibiótico Blasticidina e que deveria servir para selecionar apenas as células em que a tag havia sido corretamente inserida no genoma. No entanto, ainda que as células tivessem se mostrado resistentes ao antibiótico, ao analisarmos se houve de fato inserção dos construtos no genoma por PCR, percebemos que as tags não estavam presentes na porção N-terminal das CDKs. Esses resultados nos levam a crer que uma possível inserção dos constructos em locais não específicos dentro do genoma das Drosophilas permitiu que essas células apresentassem resistência. Em uma posterior segunda tentativa, e após termos mudados a linha celular usada (S2 ao invés de DMEL) e termos substituído o agente de transfecção por FuGENE® HD, conseguimos inserir a AID-tag na porção desejada da CDK9. Por não termos tido mais tempo para inserir a tag nas demais CDKs, não foi possível estimular a degradação das mesmas pela indução com auxina. A fim de que possamos utilizar o método Degron futuramente para depletar as CDKs, alguns aspectos do método precisam ser revistos e melhorados. Visto que as células apresentaram resistência ao antibiótico Blasticidina apesar de o constructo não ter sido inserido no local desejado, isso nos leva a crer que talvez tenha havido uma inserção em outro lugar do genoma devido a falha em impedir a ocorrência de união de extremidades não homólogas (NHEJ em inglês). Uma solução possível pode ser aumentar a concentração de lig4 e mus308. Entretanto, enquanto ainda estávamos tentando inibir ou depletar as cinases transcricionais, repetidamente preparamos livrarias obtidas a partir do procedimento de NET-seq. Com essa técnica é possível detectar o transcrito nascente ainda acoplado a Pol II e sequenciá-lo com alta resolução os nucleotídeos nele presentes. Os protocolos disponíveis sobre a versão dessa técnica que faz uso de anticorpos para diversos perfis de fosforilação do CTD foram descritos para células de mamíferos (mNET-seq) ou embriões de Drosophila (dNET-seq). Apesar de similar em alguns pontos, o protocolo usado para essa dissertação teve de ser adaptado para células de Drosophila em cultura (DMEL). Para tanto, fizemos ensaios para testar a melhor concentração e tempo de digestão da enzima MNase. Também testamos diferentes concentrações de anticorpo e avaliamos a quantidade de beads necessária para a imunoprecipitação de Pol II. Tínhamos predito para esse trabalho a partir do uso do NET-seq, perceber mudanças nas pausas típicas para a Pol II downstream da 3’ SS como também alterações nas dinâmicas de splicing ao impedir a fosforilação de Ser5. No entanto, apesar de termos focado em uma possível correlação entre a ser5P e splicing, a técnica de Degron combinada ao NET-seq pode vir a ser utilizada para estudar o envolvimento de diversos fatores e o comportamento do Pol II CTD durante outros processos co-transcricionais como corte e adição da cauda poli(A). Portanto, acreditamos que a junção dessas duas técnicas pode vir a ser bastante útil no descobrimento de relações ainda pouco exploradas no que diz respeito às modificações pós-traducionais do CTD e a formação e edição do transcrito nascente.Splicing represents an incredible mechanism for evolutionary novelty: the possibility of a single gene to be expressed in the form of multiple, diverse transcripts. However, splicing dysregulation can lead to several disorders by compromising the correct production of functional proteins. In order to address the challenges originated by mis-splicing and its consequences in human health, it would be most fitting to understand better the intricate dynamics in which splicing occurs. It is well known that splicing can be coupled to transcription by the RNA Polymerase II. More specifically, the Carboxy-Terminal Domain (CTD) of the largest Pol II subunit capable of extensive post-translational modifications, is implicated in the regulation of transcription as well as most pre-mRNA processing changes. Regarding co-transcriptional splicing, recent findings show an association of CTD Ser5 phosphorylation with spliceosome machinery and spliced reads near Pol II positioning in human and Drosophila melanogaster, respectively. However, it is still not understood the role of this modification in the regulation of this process. To test the hypothesis of Ser5 phosphorylation requirement for close proximity splicing occurrence, we decided to prevent this phosphorylation to occur by inhibiting the Cyclin-Dependent Kinases (CDKs), known to phosphorylate the heptad residues in the CTD, in our selected model system, Drosophila cells. First, we inhibited the CDKs by using pharmacological inhibitors, and once this attempt failed to prevent Ser5 phosphorylation, we decided to implement the Auxin-Inducible Degron (AID) system to efficiently deplete these kinases. For that, we had to adapt and improve a CRISPR/Cas9 method to integrate the AID-tags into endogenous CDKs genes by homologous recombination. We were able to design and generate the transfection PCR products for the transcriptional CDKs 7, 9 and 12. However, only the AID-tag for CDK9 was successfully inserted at the desired location at the Drosophila genome. In order to investigate the differences originated in co-transcriptional splicing by the absence of phosphorylation, we intended to use Native Elongating Transcript Sequencing (NET-seq) to analyze with nucleotide resolution nascent transcripts associated with elongating Pol II. For that, we had to adapt and optimize mNET-seq to Drosophila culture cells.Com o patrocínio do Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes (IMM-JLA).Prudêncio, Pedro António PereiraRodrigues, Cecília Maria PereiraRepositório da Universidade de LisboaCunha, Thais Souza2022-09-20T11:33:40Z2021-12-212021-11-262021-12-21T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/54523TID:202952886enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:00:57Zoai:repositorio.ul.pt:10451/54523Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:05:20.328274Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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