Angiogenesis in atherosclerosis: expression analysis of notch signaling components in human atherosclerotic lesions

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Coutinho, Constança d'Orey Pereira
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/27660
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
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spelling Angiogenesis in atherosclerosis: expression analysis of notch signaling components in human atherosclerotic lesionsAngiogéneseAteroscleroseD114-NotchPlacas ateroscleróticas de carótidas humanasVasa vasorumTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A aterosclerose é uma doença degenerativa das artérias de grande e médio calibre, que se caracteriza pela ocorrência de disfunção endotelial, inflamação vascular, e acumulação de lípidos, cálcio, colesterol e detritos celulares na camada íntima. Estes eventos patológicos levam à formação da placa aterosclerótica (ateroma), remodelação vascular, obstrução luminal, alterações no fluxo sanguíneo, e diminuição do fornecimento de oxigénio a órgãos alvo, o que pode resultar em eventos cardíacos isquémicos e acidente vascular cerebral. Os factores de risco que aceleram significativamente o processo de aterogénese (i.e., formação de placas ateroscleróticas na parede interna do vaso sanguíneo) são a hipertensão, diabetes, tabagismo, obesidade, estilo de vida sedentário, factores hereditários, bem como elevados níveis de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e baixos níveis de lipoproteínas de alta densidade (HDL). O desenvolvimento de placas ateroscleróticas pode ser classificado em diversas fases. Hoje em dia a classificação recomendada pela American Heart Association (AHA) consiste em oito categorias que incluem lesões iniciais (assintomáticas; tipos I-III) e lesões avançadas (sintomáticas; tipos IVVIII), cada uma com características histológicas específicas. Com o crescimento progressivo da placa aumenta também o grau de estenose luminal. Para pacientes sintomáticos com estenose severa (maior que 70%) é recomendada endarterectomia da carótida, um procedimento cirúrgico que consiste na remoção da placa aterosclerótica. Para casos sintomáticos de estenose entre 50 a 69% os benefícios da cirurgia existem mas são menores. Por outro lado, para pacientes assintomáticos que apresentem grau de estenose maior que 70% a endarterectomia da carótida é também indicada mas com uma eficiência significativamente inferior. As amostras obtidas a partir desta cirurgia são muitas vezes utilizadas em estudos histológicos, tal como foi o caso deste projecto. Existem três grandes mecanismos de disrupção da placa aterosclerótica que podem levar a eventos trombóticos: ruptura da cápsula fibrosa, erosão superficial e disrupção dos vasos sanguíneos que se formam no interior da placa (com maior importância para este trabalho). O desenvolvimento progressivo da placa aterosclerótica está associado ao processo de angiogénese, isto é, ao crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos vasa vasorum da camada adventícia, que se estendem através das camadas média e íntima. Estes microvasos recém-formados são imaturos, frágeis e permeáveis, podendo levar a hemorragias no interior da placa. A consequente acumulação de eritrócitos e inflamação provocam ruptura das placas mais vulneráveis, originando trombose arterial e obstrução vascular. A grande importância destes microvasos em ateromas tem sido revelada em estudos com modelos animais de ratinhos deficientes na apolipoproteína-E (ApoE-/-), mostrando que a inibição da neovascularização com inibidores de angiogénese leva a uma diminuição acentuada do crescimento da lesão. Em placas ateroscleróticas humanas, onde os microvasos já existem, a estabilização ou “normalização” da microvasculatura imatura tem sido proposta como uma estratégia para prevenir a hemorragia intraplaca e restringir o tamanho da lesão, promovendo assim a sua estabilização. Os vasos normalizados são menos frágeis, dilatados e sinuosos, apresentando uma membrana basal normal e uma maior cobertura de pericitos (indicador de maturidade vascular). Além de prevenir a hemorragia intraplaca, estes vasos normalizados irão também permitir uma melhor perfusão de agentes terapêuticos para o interior da placa. A grande diversidade de indutores angiogénicos, incluindo factores de crescimento, quimiocinas, enzimas angiogénicos, receptores específicos endoteliais e moléculas de adesão, representa uma grande variedade de potenciais alvos terapêuticos para a restrição da neovascularização patológica. Dentro destes, a via de sinalização Delta-like 4 (Dll4)/Notch merece um foco especial, uma vez que ao apresentar um papel crucial no desenvolvimento vascular embrionário e na angiogénese fisiológica e patológica, possuí um elevado potencial terapêutico para doenças associadas a proliferação vascular anómala, como é o caso da aterosclerose. Os componentes principais da via de sinalização Notch no sistema vascular incluem três ligandos, DLL4, Jagged1 (JAG1), e Jagged2 (JAG2); três receptores, NOTCH1, 3 e 4; e três genes alvos, HERP1/HEY2, HERP2/HEY1, e HERP3. A maioria dos estudos funcionais que incidem sobre os factores reguladores da angiogénese tem sido realizada em tumores pelo facto de representarem um potencial alvo terapêutico. DLL4 é fundamental para a maturação dos vasos recém-formados. Tem sido demonstrado que a inibição da via de sinalização Dll4/Notch bem como o tratamento com anticorpos anti-DLL4 levam a um aumento significativo da densidade vascular, mas simultaneamente restringem o tamanho do tumor, uma vez que os microvasos formados são imaturos e têm baixa capacidade de perfusão. Por outro lado, a sobre expressão da via de sinalização Dll4/Notch resulta numa diminuição da densidade vascular tumoral, com vasos tumorais menos ramificados mas funcionais. Indo de acordo com o observado na vasculatura tumoral, os nossos trabalhos piloto demonstraram que Dll4 também é expresso nos vasa vasorum de placas ateroscleróticas de ratinhos ApoE-/-. Desta forma, a via de sinalização Notch apresenta-se como um potencial regulador da maturação dos vasa vasorum em lesões ateroscleróticas. Torna-se assim importante determinar o papel da via de sinalização Dll4/Notch na angiogénese e progressão de lesões ateroscleróticas humanas. O presente estudo teve como objectivo analisar a expressão de componentes da via de sinalização Dll4/Notch em ateromas humanos, e correlacionar os seus níveis com o grau de maturação dos vasa vasorum e com a fase de progressão da lesão. Para tal, um fragmento de cada amostra (i.e., ateroma da carótida) foi avaliado e classificado conforme o tipo de lesão aterosclerótica (fase de progressão) através de coloração com Hematoxilina-Eosina, e posteriormente a expressão de componentes da via de sinalização Dll4/Notch e de marcadores de maturação vascular foi analisada por imunomarcação de cortes histológicos (imunofluorescência). Inicialmente, procedemos à optimização do protocolo de imunofluorescência em amostras de ateroma humano não incluídas nos grupos experimentais, tendo como objectivo minimizar a autofluorescência natural que estes tecidos apresentam. Secções histológicas de placenta foram usadas como controlo positivo para avaliar se determinados anticorpos primários marcavam correctamente as células esperadas, bem como para determinar a concentração óptima de anticorpo a utilizar. Os nossos resultados mostram uma associação entre a densidade microvascular e a progressão da lesão aterosclerótica, sendo que as lesões mais avançadas apresentam mais microvasos com menor cobertura de pericitos, o que indica imaturidade da neovasculatura. Paralelamente, a expressão de DLL4 é detectada a baixos níveis em lesões precoces e a níveis mais elevados em lesões mais avançadas. Estas observações indicam que o número de células endoteliais que expressam DLL4 aumenta à medida que os microvasos imaturos proliferam durante a progressão da lesão. Apesar de não ter mostrado correlação com o grau de lesão, foi possível verificar também a presença do receptor NOTCH1 em lesões mais avançadas, mostrando ser expresso em células endoteliais de microvasos imaturos. Tínhamos ainda como objectivo inicial avaliar por PCR em tempo real os níveis de expressão e activação da via de sinalização Notch e outras vias de sinalização envolvidas na angiogénese e/ou inflamação e maturação dos vasos. Contudo, apesar dos diferentes testes utilizados, não foi possível contornar a existência de contaminação genómica no cDNA que nos foi fornecido, entre outros problemas técnicos, e assim este ensaio não pôde ser optimizado nem finalizado. Em conclusão, os resultados deste projecto contribuiram para elevar o nível de conhecimento em relação aos reguladores moleculares da angiogénese em lesões ateroscleróticas humanas, clarificar a correlação entre a maturação dos vasa vasorum e a progressão das placas, e dar suporte à hipótese de utilização de Dll4/Notch como um novo alvo terapêutico na estabilização das lesões ateroscleróticas.Atherosclerosis is a degenerative disease of large muscular and elastic arteries characterized by endothelial dysfunction, vascular inflammation, and the progressive development of intima plaques (atheroma). As the atherosclerotic plaque develops, the process of angiogenesis occurs, with the growth of new vessels arising from the adventitial vasa vasorum into the media and intima layers. This modulates plaque growth and stability. The new microvessels are immature, fragile, leaky and may lead to intraplaque hemorrhages, thrombosis and vessel obstruction. Inhibition of atheroma neovascularization has therefore been proposed as an approach to restrict lesion growth promoting its stabilization. Delta-like 4 (Dll4)/Notch pathway has been implicated in the regulation of angiogenesis and blood vessel maturation, which introduces DLL4 as potential target for atherosclerosis treatment. In this study, the expression patterns of DLL4/Notch pathway components were analyzed by immunolabeling of histological sections from human atherosclerotic plaque samples. These expression patterns were correlated with the level of vasa vasorum maturation and type of atherosclerotic lesion (progression stage). In summary, the expression results indicated that more advanced lesions present more microvessels but these have less pericyte coverage, which underscores the immaturity of this neovasculature. In parallel, the expression of DLL4 is detected in lower levels in vasa vasorum of early lesions and at higher levels in more advanced plaques. These observations indicate that the number of endothelial cells expressing DLL4 increases as immature microvessels proliferate during disease progression. Although it did not present significant correlation with lesion progression, it was also possible to detect the presence of NOTCH1 receptor in endothelial cells of immature microvessels in advanced lesions. This research contributed to rise our level of knowledge on the molecular regulators of angiogenesis in human atherosclerotic lesions, elucidate the correlation between vasa vasorum maturation and plaque progression, and support a potential therapeutic application of Dll4/Notch signaling modulators in the stabilization of atherosclerotic lesions.Tavares, Ana Teresa,1971-Crespo, Ana Maria Viegas,1946-Repositório da Universidade de LisboaCoutinho, Constança d'Orey Pereira2017-05-10T15:40:30Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/27660TID:201856689enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:18:48Zoai:repositorio.ul.pt:10451/27660Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:44:02.814729Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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