Generation and characterization of functional sensory neurons from hESCs and hiPSCs

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Sousa, André Filipe Santos
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/33508
Resumo: SOUSA, André Filipe Santos - Generation and characterization of functional sensory neurons from hESCs and hiPSCs. Coimbra : [s.n.], 2016. Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular.
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spelling Generation and characterization of functional sensory neurons from hESCs and hiPSCsCélulas estaminaisDiferenciaçãoNeurónios sensoriaisNociceptorsDorTRP channelsRMCEAumento de expressãoFatores de transcriçãoSOUSA, André Filipe Santos - Generation and characterization of functional sensory neurons from hESCs and hiPSCs. Coimbra : [s.n.], 2016. Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular.The lack of access to the neuronal tissue, limited our understanding about its development and physiology of pain in humans. Therefore, the generation of functional human sensory neurons for disease modelling, drug screening and clinical applications is an urgent and unmet need. Nociceptors are the sensory neurons related to sense the pain, characterized by the presence of transient receptor potential channels which have sensory functions linked to transduction of noxious stimuli as well as signalling within the pain system. In this thesis, we first characterized the nociceptors generated from induced pluripotent stem cell with a protocol developed on the laboratory, comparing it to a protocol described by Young et al., 2014. We used techniques as real-time reverse transcription-polymerase chain reaction and staining to check the neuronal phenotyping of the cells generated, as well as calcium imaging as a functional assay, to test about the functionality of transient receptor potential (TRP) channels, in order to characterize the neurons generated. We showed that only after 50 days of differentiation with both protocols we can have functional mature sensory neurons, with transient receptor potential cation channel sub family V, member 1 and transient receptor potential cation channel subfamily A, member 1 being activated. Moreover, the best results were achieved with the adapted protocol. Next, we focused on different approaches to improve the differentiation protocol. Changing cell line and replating dilution, did not enhance the protocol. Hence, we next hypothesized that current hurdles to speed up differentiation might be overcome by overexpression of key transcription factors involved in the sensory neurons differentiation: PR domain 12, brain-specific homeobox 3A, insulin gene enhancer and kruppel-link zinc finger transcription factor. A technique used on the laboratory, recombinase-mediated cassette exchange, was employed to generate two cell lines, one overexpressing PRDM12 and the other overexpressing ISL1-BRN3A-KLF7. We proved that in the new cell lines, the transcription factors were being correctly overexpressed, and collectively our results demonstrate that overexpressing PRDM12 improves the homogeneity of the cells generated. Further studies are required to evidence the impact of this new cell lines on the upgrading of the differentiation protocol. This work will open new opportunities for investigating in vitro disease modelling and evaluation of pharmacological responds to pain research.A falta de acesso ao tecido neuronal limita o nosso conhecimento acerca do seu desenvolvimento e da fisiologia da dor nos humanos. Portanto, a geração de neurónios sensoriais humanos funcionais de forma à criação de modelos de doenças relacionadas com a dor, triagem de drogas e aplicações clinicas é uma necessidade urgente e não atendida. Os nociceptors são os neurónios sensoriais responsáveis por receber o estímulo da dor, caracterizados pela presença dos TRP channels que têm funções sensoriais na medida em que estão ligados à transdução de estímulos nocivos assim como à sinalização dentro do sistema da dor. Nesta tese, primeiramente caracterizamos os nociceptors gerados a partir de células estaminais recorrendo a um protocolo desenvolvido no nosso laboratório, comparando-o a um protocolo descrito por Young et al., 2014. Foram usadas técnicas como qRT-PCR e staining, de forma a conferirmos o fenótipo neuronal das células geradas, assim como calcium imaging como um teste funcional acerca da atividade dos TRP channels com o objetivo de caracterizarmos os neurónios gerados. Aqui, demonstramos que apenas após 50 dias de diferenciação com ambos protocolos conseguimos obter neurónios sensoriais maduros funcionais, com a ativação de TRPV1 e TRPA1. Ainda, o protocolo adaptado no laboratório teve melhores resultados. De seguida, focamo-nos nas várias formas de melhorarmos o protocolo de diferenciação. Mudar a linha celular usada e a diluição na fase de replating não aperfeiçoou o protocolo. Sendo assim, supomos que as barreiras em conseguir uma diferenciação mais rápida podiam ser ultrapassadas pelo aumento de expressão de fatores de transcrição envolvidas na diferenciação de neurónios sensoriais: PRDM12, BRN3A, ISL1 e KLF7. Uma técnica usada no laboratório, RMCE, foi usada de forma a gerar duas linhas celulares, uma com o aumento de expressão de PRDM12, e a outra com o aumento de expressão de ISL1, BRN3A e KLF7. Neste trabalho provamos que as novas linhas celulares estavam de facto com a expressão aumentada dos fatores de transcrição inseridos, e os nossos resultados demonstram que o aumento de expressão de PRDM12 contribuiu para o melhoramento da homogeneidade das células geradas. Futuros estudos têm de ser feitos de forma a evidenciar o impacto destas duas novas linhas celulares no aprimoramento do protocolo de diferenciação. Este trabalho vai abrir novas oportunidades para a investigação in vitro de modelos de doenças e a avaliação de respostas farmacológicas na investigação da dor.2016info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/33508http://hdl.handle.net/10316/33508engSousa, André Filipe Santosinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2022-01-21T17:17:01Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/33508Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:56:36.186917Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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