Post-translational modifications of Ataxin-3, the protein involved in Machado-Joseph disease

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Matos, Carlos
Data de Publicação: 2009
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/27048
Resumo: Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
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spelling Post-translational modifications of Ataxin-3, the protein involved in Machado-Joseph diseaseDoença de Machado-JosephDoenças de poliglutaminasAtaxina-3Domínio JosephinFosforilaçãoSumoilaçãoDissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraMachado-Joseph disease (MJD), the most common form of autosomal dominantly-inherited ataxia, belongs to a group of neurodegenerative disorders sharing the attribute of being caused by unstable expansions of CAG codon repeats in the respective genes. These disorders are collectively named as polyglutamine (polyQ) expansion diseases, since that expansion is translated as a lengthy glutamine sequence in the otherwise unrelated proteins encoded by each gene. Ataxin-3 (atx3), the protein associated with MJD, is a deubiquitinating enzyme (DUB) which mainly comprises a N-terminal catalytic domain, termed Josephin domain (JD), and a C-terminal tail that contains two or three ubiquitin-interacting motifs (UIMs) and the polyQ stretch. Though its concrete biological function remains to be elucidated, information regarding atx3 activity and molecular interactions points out some involvement with the ubiquitin-proteasome pathway (UPP) and with transcription regulation. To this date, the experimentally observed deubiquitinating activity has been reported as being very low, being admitted that, as with many other DUBs, atx3 activity may be closely regulated and thus require external factors to reach optimal levels. The way expanded atx3 and every other polyQ-expanded proteins lead to the corresponding diseases also remains to be determined but, though it is admitted that there are some events common to all of the diseases (including formation of toxic protein aggregates), the different properties of each particular protein hosting the polyQ expansion are probably the cause of the different profiles exhibited by each polyQ expansion disease. One way by which this protein context may play a role in these neurodegenerative diseases is related to the differential susceptibility to be targeted by post-translational modifications (PTMs), a group of ubiquitous and frequently reversible mechanisms that regulate many protein properties, modulating their function, subcellular localization and interactions. Importantly, cell-specific differences in protein properties resulting from differential regulation by PTMs may explain the region-specific 2 degeneration observed in every polyQ expansion disease. Many PTMs targeting polyQ expansion proteins have been related with the regulation of some of their properties and sometimes seen as interfering with events involved in disease development. In the particular case of atx3, PTMs also constitute a promising mechanism for regulation of its deubiquitinating activity. Consequently, the goal of the current work was to identify novel PTMs of atx3. We chose to focus our attention on phosphorylation and sumoylation, two PTMs that have been associated with regulation of both DUBs and polyQ expansion proteins. In order to identify new phosphorylation sites in atx3, we immunoprecipitated an atx3 fusion protein from transfected HEK 293FT cells and analyzed it recurring to a mass spectrometric strategy specially directed at the mapping of phosphorylation sites. This analysis determined for the first time that serine 12 of atx3 is phosphorylated. Usage of no artificial stimulus other than that of the phosphatase inhibitor okadaic acid (OA) prompts us to admit that this modification occurs normally in HEK 293FT cells. After analyzing the tertiary structure of the JD and observing the proximity of this amino acid to those of the active site of the protein, we speculate that this modification likely influences atx3 deubiquitinating activity. As for sumoylation, we submitted 6His-tagged JD purified from E. coli to an in vitro sumoylation assay and concluded that it conjugated with small ubiquitin-like modifier 2 (SUMO2). Though we were unable to confirm this result in vivo, it constitutes the first evidence for sumoylation of atx3 and indicates that the catalytic domain of the protein is a target for this modification. Further study of the PTMs we identified and subsequent characterization of the way they regulate atx3 properties may help us increase our knowledge about atx3 function and the mechanisms responsible for MJD developmentA doença de Machado-Joseph (MJD), a ataxia com hereditariedade autossómica dominante mais comum, pertence a um grupo de doenças neurodegenerativas que partilham o facto de serem causadas por expansões instáveis de repetições de codões CAG nos genes correspondentes. Estas desordens são colectivamente designadas doenças de poliglutaminas (polyQ), uma vez que a expansão é traduzida como uma sequência expandida de glutaminas nas proteínas codificadas por cada gene; essas proteínas não estão, de outro modo, relacionadas. A ataxina-3 (atx3), a proteína associada à MJD, é uma enzima com actividade de hidrolase de ubiquitinas (DUB) formada por um domínio catalítico presente no terminal amino, designado de domínio Josephin (JD), e por uma cauda presente no terminal carboxílico, que contém dois ou três motivos de interacção com ubiquitina (UIMs) e a sequência de polyQ. Embora a função fisiológica desta proteína permaneça ainda desconhecida, as informações existentes acerca da actividade da atx3 e das interacções moleculares que estabelece indiciam um certo envolvimento com a via da ubiquitina-proteossoma (UPP) e com a regulação da transcrição. Até à data, a actividade proteolítica detectada experimentalmente tem sido considerada muito baixa, admitindo-se que, tal como acontece com muitas outras DUBs, a actividade da atx3 deverá ser estritamente regulada e necessitará, portanto, de factores externos para atingir níveis fisiologicamente significativos. A forma como a atx3 expandida e todas as outras proteínas com uma expansão de polyQ conduzem às doenças em questão também não foi ainda determinada, mas, embora se admita que certos acontecimentos são comuns a todas as patologias (incluindo a formação de agregados tóxicos de proteínas), reconhece-se que as diferentes propriedades de cada proteína que contém a expansão de polyQ são a causa dos diferentes perfis apresentados por cada doença de polyQ. Um modo através do qual este contexto proteico pode ser importante relaciona-se com a 4 diferente susceptibilidade para ser alvo de modificações pós-traducionais (PTMs), um grupo de mecanismos ubíquos e frequentemente reversíveis que regulam muitas propriedades das proteínas, modulando a sua função, a sua localização subcelular e as suas interacções. Um aspecto a ter em conta é a eventual possibilidade de se vir a explicar a degeneração específica de determinadas regiões do sistema nervoso que se observa em todas as doenças de expansão de polyQ como resultado de diferenças nas propriedades das proteínas que resultem de uma regulação diferencial por PTMs. Muitas PTMs de proteínas com expansão de polyQ têm sido relacionadas com algumas das suas propriedades e, por vezes, admitidas como interferindo em processos relacionados com o desenvolvimento das patologias. No caso particular da atx3, as PTMs poderão também constituir um mecanismo promissor de regulação da sua actividade de hidrolase de ubiquitina. Consequentemente, o objectivo deste trabalho era identificar novas PTMs da atx3. Escolhemos concentrar a nossa atenção na fosforilação e na sumoilação, duas PTMs que têm sido associadas tanto com a regulação das DUBs como das proteínas com expansão de polyQ. De modo a identificar novos locais de fosforilação da atx3, imunoprecipitámos uma proteína de fusão da atx3 a partir de células HEK 293FT e analisámos a amostra recorrendo a um método de espectrometria de massa especialmente direccionado para o mapeamento de locais de fosforilação. Esta análise determinou pela primeira vez que a serina 12 da atx3 é fosforilada. O facto de não ter sido usado nenhum estímulo artificial à excepção do ácido okadaico, um inibidor de fosfatases, leva-nos a admitir que esta modificação ocorre normalmente em células HEK 293FT. A análise da estrutura terciária do JD e consequente observação da proximidade entre este aminoácido e os aminoácidos do local activo da proteína leva-nos a especular que é provável que esta modificação influencie a actividade proteolítica da atx3. No que diz respeito à sumoilação, submetemos 6His-JD purificado a partir de E. coli a um ensaio de sumoilação in vitro e concluímos que ele se conjugava com SUMO2. Embora não tenha sido possível confirmar este resultado in 5 vivo, esta é a primeira prova de sumoilação da atx3 e indica que o domínio catalítico da proteína é alvo desta modificação. A continuação do estudo das PTMs que identificámos e subsequente caracterização do modo como regulam as propriedades da atx3 poderão ajudar-nos a compreender melhor a função da atx3 e os mecanismos responsáveis pela MJD.2009info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/27048http://hdl.handle.net/10316/27048engMatos, Carlosinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2022-01-20T17:48:33Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/27048Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:56:51.770234Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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