Development of novel antibody-based Ataxin-3 bioimaging probes to track the progression of Machado-Joseph disease

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Vaz, Beatriz Lourenço
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/105578
Resumo: Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia
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spelling Development of novel antibody-based Ataxin-3 bioimaging probes to track the progression of Machado-Joseph diseaseDesenvolvimento de novos anticorpos contra Ataxina-3 como sondas de bioimagem para rastreio da progressão da doença de Machado-JosephDoença de Machado-JosephAtaxina-3Barreira hematoencefálicaRecetor de transferrinaImunoglobulina YMachado-Joseph diseaseAtaxin-3Blood-brain barrierTransferrin ReceptorImmunoglobulin YDissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de FarmáciaA doença de Machado-Joseph (MJD) é uma doença neurodegenerativa pertencente ao grupo de doenças de poliglutaminas (polyQ). A doença é causada pela expansão anormal do trinucleótido CAG na região codificante do gene da proteína Ataxina-3 (ATXN3). As expansões na região polyQ da Ataxina-3 (Atx3) estão correlacionadas com o potencial de agregação da proteína, especialmente dentro do núcleo de neurónios em regiões cerebrais suscetíveis. O diagnóstico atempado e preciso da MJD é crítico na prática clínica e por isso novos métodos e ferramentas para rastrear a progressão da doença são prioritários. Neste trabalho focámo-nos no desenho e caracterização preliminar de novas sondas de bioimagem para monitorização da MJD in vitro e in vivo, utilizando anticorpos IgY de aves contra a Ataxina-3 e o receptor da transferrina (TfR).Análises de estrutura e sequência das proteínas Atx3 e TfR de ratinho e humano permitiram a seleção e o desenho de epítopos proteicos específicos como alvos de anticorpos. Versões recombinantes destes epítopos foram produzidas e utilizadas como imunogénios para o desenvolvimento de anticorpos em aves (galinhas). O título de anticorpos específicos foi avaliado em amostras de gema de ovo hiperimunes e os anticorpos foram posteriormente purificados por cromatografia de afinidade e caracterizados por ensaios de Western e Dotblot. Dos quatro anticorpos desenvolvidos contra a Atx3, todos revelaram reatividade contra o seu epítopo alvo específico, sendo que um em particular revelou um comportamento promissor para trabalhos subsequentes - Anti-Atx3 epítopo aa 278-292 - com um sinal claro e robusto contra o alvo recombinante. Resultados semelhantes foram obtidos para três anticorpos desenvolvidos contra o TfR, destacando-se também de entre estes o anticorpo - Anti-TfR epítopo aa 206-219 - revelando resultados de targeting específico consistentes. Além disso, o enriquecimento de anticorpos específicos, utilizando um processo de purificação com duas etapas, uma primeira etapa cromatográfica de clearance e uma segunda etapa cromatográfica imunogénio-específica, resultou em melhorias na especificidade do anticorpo, nomeadamente para o anticorpo proeminente de TfR. Os resultados obtidos suportam o potencial dos novos anticorpos IgY anti-Atx3 e anti-TfR como base para o desenvolvimento de sondas de imagem para estudar a progressão da MJD.O trabalho consolidou também uma metodologia completa para o desenvolvimento de sondas de imagem, utilizando anticorpos IgY, capazes de contornar a barreira hematoencefálica (BBB)por transcitose mediada por TfR e, portanto, transversal para o estudo de outras doenças neurodegenerativas.Machado-Joseph disease (MJD) is a neurodegenerative disorder belonging to the group of polyglutamine (polyQ) diseases. The disease is caused by the abnormal expansion of the CAG trinucleotide in the coding region of Ataxin-3 gene (ATXN3). PolyQ tract expansions inAtaxin-3 (Atx3) are well correlated with the aggregation potential of the protein, especially within the nucleus of neurons in susceptible brain regions. A timely and accurate diagnosis of MJD is greatly needed in clinical practice and novel methods and tools to track the progression of the disease are of high priority. In this work we focused on the design and preliminary characterisation of novel bioimaging probes for MJD monitoring in vitro and in vivo, making use of avian IgY antibodies against Ataxin-3 and the Transferrin receptor (TfR). Protein structure and sequence-based analysis of both mouse and human Atx3 and TfR enabled the selection and design of specific protein epitopes to be targeted by antibodies. Recombinantversions of such epitopes were produced and used as immunogens for antibody development in avian hosts (chickens). Epitope-specific antibody titers were evaluated in hyperimmune egg yolk samples and antibodies were further purified by affinity chromatography and characterised by Western and Dot blot assays. Out of four Atx3 antibodies developed, all recognizing their specific target epitope, one revealed a particular promising behaviour for subsequent work - Anti-Atx3 epitope aa 278-292 - with a clear and robust signal against the recombinant target. Similar results were obtained for three TfR antibodies developed, with also a prominent one - Anti-TfR epitope aa206-219 - revealing consistent specific targeting results. Moreover, specific antibody enrichment, using a two-step process, with a first clearance chromatographic step and a second immunogen-specific chromatographic step, resulted in improvements of antibody specificity, namely for the TfR prominent antibody. The results support the potential of the novel IgY anti-Atx3 and anti-TfR antibodies for the ultimate development of imaging probes to study MJD progression. The work also consolidated a full methodological setup for the development of imaging probes, capable of bypassing the blood-brain barrier (BBB) through TfR-mediated transcytosis, and therefore translatable to study of other neurodegenerative diseases.FCT2022-10-042028-10-02T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/105578http://hdl.handle.net/10316/105578TID:203241460engVaz, Beatriz Lourençoinfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-10-27T11:12:37Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/105578Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:22:07.911827Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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