Molecular and functional analysis of mutations in the transcription factor ZNF687 associated to Paget disease of bone

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Authier, Tatiana Marine da Silva
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.1/13585
Resumo: The zinc finger protein ZNF687 is a transcription factor containing various Cys2-His2 zinc finger domains that has been related to Paget’s disease of bone (PDB) associated with giant cell tumor of bone. Recently, four mutations have been independently identified in a Southern Italian population, and were determined as predisposal (p.Ser242Ile, p.Pro665Leu, and p.Gln784Glu,) or causal (p.Pro937Arg) for development of PDB. Moreover, it has been suggested that ZNF687 plays an important role in bone metabolism in both human and zebrafish, and that the function of this protein might be conserved throughout evolution. Nonetheless, the mechanism by which ZNF687 affects bone metabolism, and hence, PDB, remains to be elucidated. To contribute to respond to these questions we have proposed to perform in silico analysis in order to investigate how these four mutations could affect the protein conformation and function, and in vitro analyses to evaluate how mutant ZNF687 (p.Pro937Arg, mediated by site-directed mutagenesis), ZNF687 overexpression (mediated by transient transfection) and ZNF687 knock-down (mediated by CRISPR-Cas9), could affect the expression of genes involved in bone metabolism. We also assessed the mineralization process of knock-down clones and evaluated specific gene expression. Lastly, comparative in silico and in vitro analyses were performed in order to define the usefulness of zebrafish as a biological model for ZNF687 study. Therefore, the mutation analysis suggested alterations in protein-protein and protein-acid nucleic interactions that might distort ZNF687 target genes expression and lead to PDB. Moreover, preliminary results suggested that ZNF687 might regulate genes involved in osteoblastogenesis and osteoclastogenesis, such as RUNX2, OSX, RANK, SQSTM1 and OPTN, while its role in mineralization remained uncleared. Finally, by identifying significant similarities in genomic structure, protein domain, and molecular players affecting znf687a, znf687b and ZNF687 transcription, together with the identification and characterization of promoter’s regions that regulate the transcription of znf687a and human ZNF687 genes, we have confirmed that zebrafish is a useful biological model system to study ZNF687.
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spelling Molecular and functional analysis of mutations in the transcription factor ZNF687 associated to Paget disease of boneZNF687Doença ossea de PagetOsteoblastogeneseOsteoclastogeneseCRISPR-Cas9Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Outras Ciências MédicasThe zinc finger protein ZNF687 is a transcription factor containing various Cys2-His2 zinc finger domains that has been related to Paget’s disease of bone (PDB) associated with giant cell tumor of bone. Recently, four mutations have been independently identified in a Southern Italian population, and were determined as predisposal (p.Ser242Ile, p.Pro665Leu, and p.Gln784Glu,) or causal (p.Pro937Arg) for development of PDB. Moreover, it has been suggested that ZNF687 plays an important role in bone metabolism in both human and zebrafish, and that the function of this protein might be conserved throughout evolution. Nonetheless, the mechanism by which ZNF687 affects bone metabolism, and hence, PDB, remains to be elucidated. To contribute to respond to these questions we have proposed to perform in silico analysis in order to investigate how these four mutations could affect the protein conformation and function, and in vitro analyses to evaluate how mutant ZNF687 (p.Pro937Arg, mediated by site-directed mutagenesis), ZNF687 overexpression (mediated by transient transfection) and ZNF687 knock-down (mediated by CRISPR-Cas9), could affect the expression of genes involved in bone metabolism. We also assessed the mineralization process of knock-down clones and evaluated specific gene expression. Lastly, comparative in silico and in vitro analyses were performed in order to define the usefulness of zebrafish as a biological model for ZNF687 study. Therefore, the mutation analysis suggested alterations in protein-protein and protein-acid nucleic interactions that might distort ZNF687 target genes expression and lead to PDB. Moreover, preliminary results suggested that ZNF687 might regulate genes involved in osteoblastogenesis and osteoclastogenesis, such as RUNX2, OSX, RANK, SQSTM1 and OPTN, while its role in mineralization remained uncleared. Finally, by identifying significant similarities in genomic structure, protein domain, and molecular players affecting znf687a, znf687b and ZNF687 transcription, together with the identification and characterization of promoter’s regions that regulate the transcription of znf687a and human ZNF687 genes, we have confirmed that zebrafish is a useful biological model system to study ZNF687.A proteína dedo de zinco 687 (ZNF687) é um fator de transcrição que contem vários motivos Cis2-His2, sendo um dos motivos mais comuns de ligação ao DNA encontrados nos fatores de transcrições dos eucariotas. O gene ZNF687 humano tem sido associado à várias doenças, nomeadamente à leucemia mielóide aguda, à doença óssea de Paget (DOP) severa associada ao tumor de células gigantes do osso, e ao carcinoma hepatocelular, advogando um putativo papel oncogénico. Além disso, foi demostrado que a expressão de RNA mensageiro do ZNF687 era significativamente aumentada durante a osteoclastogénese e a osteoblastogénese, tanto no humano como no peixe zebra, sugerindo um papel importante no metabolismo do osso, e uma conservação quanto à função desta proteína ao longo da evolução, apesar da especiação. A doença óssea de Paget é um distúrbio metabólico crónico e raro, caracterizado por áreas focais com exagerada remodelação óssea. Com efeito, uma atividade anormal dos osteoclastos leva à reabsorção óssea excessiva, que é por sua vez, rapidamente compensada por uma hiperatividade dos osteoblastos, células responsáveis pela formação do osso. A doença pode ser monostótica ou poliostótica, mas em ambos os casos, a estrutura óssea resultante é desorganizada, desformada e frágil. A etiologia da DOP não é bem conhecida, mas um fator genético está fortemente associado à doença, existindo também um fator ambiental. Foram identificadas várias mutações em diferentes genes, nomeadamente no sequestossoma 1 (SQSTM 1), fator estimulante de colónia 1 (CSF-1), membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 11a (TNFRSF11A), superfamília 7 transmembrana 4 (TM7SF4), optineurina (OPTN), ras e intercatores rab 3 (RIN3), proteína contendo valosina (VCP), nucleoporina 205 (NUP205) e mais recentemente, ZNF687 e ribonucleoproteína nuclear heterogênea A2 / B1 (hnRNPA2B1). Recentemente, foram descritas, em estudos independentes, numa população do sul da Itália, quatro mutações associadas a DOP: três delas foram identificadas como não causais (p.Ser242Ile, p.Pro665Leu, e p.Gln784Glu) e uma delas (p.Pro937Arg) foi determinada como necessária e suficiente para desenvolver a DOP. O mecanismo pelo qual a ZNF687 afeta o metabolismo ósseo e deste modo pode causar a DOP, ainda não foi esclarecido. Para responder a estas questões, propusemos fornecer dados, realizando vários estudos in silico e in vitro. Deste modo, para estudar o efeito das mutações descritas na proteína ZNF687, efetuaram-se análises de comparação da estrutura da proteína normal versus a estrutura da proteína com as diferentes mutações. As mutações associadas a DOP não mostraram nenhuma alteração na estrutura secundária da proteína, no entanto, as diferenças nas propriedades entre os resíduos “wild-type” (WT) e os resíduos mutados podem levar às alterações, tanto na conformação local, como na interação de proteína-proteína ou de proteína-ácido nucleico. Contrariamente às mutações p.Ser242Ile e p.Pro665Leu, que não se encontram num domínio funcional, a mutação p.Glu784Gln ocorre na extremidade C-terminal de um domínio dedo de zinco (ZF), podendo afetar a interação aminoácido-DNA especifica deste local. A mutação p.Pro937Arg gera uma carga positiva adicional antes do local de sinalização nuclear (NLS). O resíduo mutado acaba por fazer parte deste NLS, tornando-o mais forte, o que pode levar a um aumento da translocação da proteína para o núcleo. Após estes resultados preliminares, fomos avaliar a expressão de genes putativos alvos da ZNF687, que estão descritos como estando envolvidos no metabolismo do osso. Para isto, a região codificante do gene, inserida num vetor de expressão, foi submetida ao processo de mutagénese dirigida para se reproduzir a mutação p.Pro937Arg. Esta construção foi posteriormente utilizada na transfeção de células SaOS-2, em paralelo com o vetor contendo a forma normal, para induzir a sobre-expressão da ZNF687 mutada e normal. Outra estratégia do nosso trabalho consistiu na obtenção de clones de células SaOS-2, em que efetuámos a repressão do gene ZNF687 através da ferramenta de edição génica, CRIPSR-Cas9. Tanto nas células submetidas a sobre-expressão como nos clones “knock-down”, o RNA foi extraído e a expressão dos níveis de mRNA de vários genes de interesse foi analisada por PCR quantitativo. Em seguida, estudámos também o processo de mineralização nos clones “knock-down” e avaliámos a expressão dos genes alvos da ZNF687. Os nossos dados preliminares sugeriram que a ZNF687 poderia desempenhar um papel regulador de RUNX2 e OSX, dois genes envolvidos na osteoblastogénese, e de RANK, SQSTM1 e OPTN, genes envolvidos na osteoclastogénese através da via de sinalização do NF-κB induzida por RANKL. No entanto, não foi possível determinar se a regulação do SQSTM1 e de OPTN pela ZNF687 dá-se de uma forma direta ou se é feita através da regulação de RANK. O mesmo pode acontecer no caso da regulação do OSX, podendo este ser diretamente regulado pelo RUNX2 e indiretamente pela ZNF687. O papel da ZNF687 no processo de mineralização também permanece incerto sendo que a diminuição dos níveis de expressão da osteocalcina (OCN) e da atividade da fosfatase alcalina (ALP), observados nos clones “knock-down”, poderia ser uma consequência da diminuição dos níveis de RUNX2, diminuição possivelmente causada pelo “knock-down” da ZNF687. Por outro lado, a expressão em células que sobre-expressam a forma mutada de ZNF687 demonstraram um padrão de expressão similar ao das células que sobre-expressam a forma WT. Anteriormente, foi descrito que a mutação p.Pro937Arg, mutação causal encontrada em pacientes com DOP, parece atuar como um ganho de função levando a um aumento da translocação de ZNF687 para o núcleo, onde a sua acumulação aumentará a expressão de genes alvos. Portanto, a alteração da expressão dos genes RUNX2, OSX, RANK, OPTN e SQSTM1, envolvidos na diferenciação dos osteoblastos e dos osteoclastos, poderá ser a causa do desenvolvimento da DOP em pacientes que apresentam essa mutação. Porém, após análises comparativas entre os genes znf687a e znf687b do peixe zebra com o gene ZNF687, foi possível sugerir que o gene znf687b era ortólogo do gene ZNF687 humano sendo que é aquele que apresentava maiores semelhanças na estrutura genómica, domínio proteico e fatores moleculares afetando a transcrição znf687a, znf687b e ZNF687. Finalmente, através da análise funcional da região promotora dos genes do peixe zebra e do humano identificou-se uma região no znf687a do zebrafish e duas regiões no ZNF687 humano como sendo responsáveis pela sua regulação. Além disso, o ensaio de co-transfecção demonstrou um efeito de repressão da transcrição da construção contendo o promotor do gene zbf687a devido ao fator de transcrição YY-1. Nos ensaios efetuados com a construção contendo o promotor do gene ZNF687 observou-se uma repressão da sua transcrição devido ao fator de transcrição AP-1. Estes resultados parecem sugerir que os promotores do gene ZNF687, tanto em humano como em peixe zebra, são regulados negativamente por factores de transcrição, que regulam genes envolvidos no desenvolvimento do osso. Estes resultados juntamente com a nossa análise in silico comparativa do locus genómico, do gene e da proteína entre as duas espécies permite-nos sugerir a potencialidade de utilizar o peixe-zebra como modelo biológico para o estudo da função da ZNF687.Cancela, LeonorConceição, NatérciaSapientiaAuthier, Tatiana Marine da Silva2021-01-30T01:30:10Z2025-01-30T00:00:00Z2019-01-302019-01-30T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.1/13585TID:202230805enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-01-10T02:00:49Zoai:sapientia.ualg.pt:10400.1/13585Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:04:44.704995Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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