Aplicação de metodologia Next Generation Sequencing na pesquisa de determinantes genéticos da febre Q crónica na via de sinalização IL12-IFNy

• Autor(a) principal: Gaspar, Ulisses Emanuel Rodrigues
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/11506
• topic: Controlo de Qualidade de Dados Genotípicos; Coxiella Burnetii; Estudos Populacionais de Associação Genótipo-Fenótipo Com Base Em Genescandidatos; Febre Q; Genética Humana da Suscetibilidade à Infecção; Imunidade Inata; Sequenciação de Nova Geração; Variação Genética do Hospedeiro Humano; Via Biológica Il12- Ifn?; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências Biomédicas

A febre Q é uma zoonose causada por Coxiella burnetii, na qual cerca de 60% dos doentes apresentam quadros clínicos de infecção aguda, com recuperação após intervenção clínica. No entanto, nos casos de febre Q crónica, a infecção culmina em complicações graves, frequentemente endocardites. Mesmo com medidas preventivas, a incidência da febre Q tem vindo a aumentar, principalmente na Península Ibérica. A fisiopatologia da infecção por C. burnetii assemelha-se à do Mycobacterium tuberculosis. Em ambas as infecções, a via interleucina12—interferão gama (IL12-IFN?) desempenha um papel importante na sobrevivência e replicação intracelular bacteriana. As doenças causadas por micobactérias apresentam homogeneidade fisiológica inerente à deficiência de interferão gama (IFN?), o que é fundamentado pela identificação de determinantes genéticos dessas infecções na via IL12-IFN?. No entanto, esta via permanece praticamente inexplorada em termos de associação genética com a febre Q crónica, enaltecendo a necessidade destes estudos. Assim, nesta investigação procurou-se identificar variantes associadas a febre Q crónica através de uma abordagem por estudos populacionais de associação genótipo fenótipo com base em genes candidatos (Candidate Gene Association Studies - CGAS). Esta abordagem insere-se numa arquitetura de estudo caso-controlo. Selecionaram-se genes candidatos e optou-se pela utilização de uma estratégia de sequenciação de nova geração (Next Generation Sequencing – NGS) para a genotipagem das regiões 5’UTR e os exões dos genes candidatos. Após consentimento informado, foram recrutados 34 indivíduos saudáveis e 60 doentes com febre Q (43 formas agudas e 17 formas crónicas). Os genes do receptor ß1 de interleucina-12 (IL12RB1), receptor 1 de interferão gama (IFN?R1) e receptor 2 de interferão gama (IFN?R2), com fragmentos de 2kb a 17kb, foram amplificados por polimerase de reação em cadeia (PCR) de longo alcance com ácido desoxirribonucleico (ADN) polimerase Takara LA Taq® para construção de bibliotecas Nextera e sequenciação com tecnologia da Illumina®. Uma vez que a NGS trabalha com milhares de milhões de dados em simultâneo requer a aplicação de várias métricas de controlo de qualidade de modo a garantir resultados fidedignos. Para além destas métricas foram ainda implementadas métricas específicas para CGAS que têm por objectivo diminuir a obtenção de erros por falsos positivos na análise estatística. Do presente trabalho de investigação resultou uma lista de polimorfismos de nucleótido único (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) dos genes IL12RB1, IFN?R1 e IFN?R2 em indivíduos com febre Q crónica, aguda e numa amostra de conveniência de indivíduos saudáveis. Estes dados têm a necessária qualidade para constituir uma mais valia, podendo ser aplicados a diferentes estudos. Futuramente, esta lista de SNPs será usada em estudos de associação genótipo-fenótipo para compreender se existem variantes na via IL12-IFN? associadas à apresentação clínica doença. Assim, estes resultados poderão vir a ser um importante avanço clínico não só para antecipar formas crónicas da doença como para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e para prestação de melhores cuidados de saúde a estes doentes.