Elucidating Gata2 transcription facto role during DNA replication and epigenetic inheritance

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Catarina Milheiro Soares da
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/88010
Resumo: Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
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spelling Elucidating Gata2 transcription facto role during DNA replication and epigenetic inheritanceElucidar o papel do fator de transcrição Gata2 durante a replicação do ADN e herança epigenéticaSinais de degradaçãoCiclo celularReplicação ADNHerança epigenéticaFator de transcriçãoTransferable Degradation SignalsCell CycleDNA ReplicationEpigenetic InheritanceTranscription FactorDissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA informação genética e epigenética, associada à definição de um padrão de expressão génica e à estrutura da cromatina, são responsáveis pela determinação da identidade celular. A manutenção da identidade e da linhagem celulares ocorrem durante o ciclo celular, uma vez que a fiel restauração da identidade de uma célula ou a sua diferenciação num tipo celular diferente, estão dependentes da conservação de marcas epigenéticas e dos padrões de expressão génica. Durante a fase S, a replicação do ADN e as alterações estruturais da cromatina permitem a duplicação dos genes e das marcas epigenéticas. Além disso, ao mesmo tempo, a maquinaria transcricional encontra-se ativa, sugerindo que os fatores de transcrição (TFs) podem possuir alguma função epigenética durante esta fase. Contudo, os mecanismos subjacentes aos eventos epigenéticos que envolvem TFs ainda não estão completamente elucidados. O fator de transcrição GATA2 é essencial à hematopoiese definitiva e apresenta um papel preponderante na reprogramação de fibroblastos em células hematopoiéticas estaminais (HSCs), possuindo potencial epigenético. Adicionalmente, o padrão oscilatório da expressão do GATA2 durante o ciclo celular demonstra que este possui níveis superiores durante a fase S. Não obstante, o papel do GATA2 na herança epigenética durante a replicação do ADN, em HSCs, permanece questionável. O objetivo deste estudo é a elucidação do papel do GATA2 durante a replicação do ADN em HSCs, através da degradação do GATA2 durante a fase S, utilizando sequências degradativas provenientes de outras proteínas. Tendo em consideração a degradação de proteínas do ciclo celular, durante a replicação do ADN, três proteínas naturalmente degradadas durante a fase S foram selecionadas, Cdt1, Cdc6 e Ciclina E, e quatro sinais degradativos foram identificados Cdt130-120, Cdc61-86, CiclinaE1-86 e CiclinaE362-393. Para validar a funcionalidade das sequências, foram produzidas proteínas de fusão usando mCherry como repórter, e estas foram expressas em células HEK293T, criando linhas celulares que expressam as proteínas de fusão de forma estável. Análise por citometria de fluxo não mostrou associação entre a expressão do gene e a distribuição das fases do ciclo celular, e o time-lapse confocal corrobora estes resultados, uma vez que não foram observadas alterações de fluorescência durante as várias fases do ciclo celular. De modo geral, os resultados obtidos sugerem que os sistemas de degradação criados necessitam de sofrer alterações. No futuro, o objetivo é a adição de um spacer entre as sequências de degradação e do repórter, uma abordagem já descrita como necessária noutros sistemas de degradação. Acreditamos que a aplicação de tecnologia de degradação a TFs, como o GATA2, ajudará a clarificar o básico dos mecanismos de herança epigenética mediados por TFs, em células estaminais.Genetic and epigenetic information, involved in gene expression pattern definition and chromatin landscape are responsible for the cellular identify establishment. Cell identity maintenance and cell fate decision events take place during the cell cycle, since faithful restoration of the cellular identity or differentiation into a different cell type are dependent on the persistence of epigenetic marks and gene expression patterns. During the S phase, DNA is replicated and the chromatin structure is altered to allow genes and epigenetic marks duplication. Moreover, at the same time, the transcriptional machinery remains active, suggesting that transcription factors (TFs) might play an epigenetic role. However, the mechanisms underlying epigenetic events involving TFs during the S phase are not completely elucidated. The TF GATA2 is essential for definite hematopoiesis and constitutes an instructive factor for the reprogramming of fibroblasts into hematopoietic stem cells (HSCs), with epigenetic potential. Additionally, GATA2 oscillatory pattern in cell cycle shows increased expression during the S phase. Nevertheless, the role of GATA2 in epigenetic inheritance during DNA replication in HSCs remains unclear. We aim at the elucidation of the role of GATA2 during DNA replication in HSCs, by degrading the TF during the S phase using transferable degradation signals. Considering the degradation of cell cycle proteins during DNA replication, we selected three proteins with a natural S phase turnover, Cdt1, Cdc6 and Cyclin E, and four degradation signals were identified Cdt130-120, Cdc61-86, CyclinE1-86 and CyclinE362-393. To validate the functionality of the sequences we have generated fusion proteins with mCherry as reporter and expressed them in HEK293T cells, creating cell lines that stably express our fusion proteins. Flow cytometry showed no association between reporter expression and cell cycle phases distribution, and confocal time-lapse imaging corroborate the same findings, since no fluorescence alteration occurs throughout the different cell cycle phases. Altogether, our results suggest that these S phase degradation systems need to be further developed. In the future, we are planning to use a spacer between the degradative and reporter sequences, an approach already described to be required in other degron-based systems. We believe that application of this degron-based technology to TFs, such as GATA2, will shed some light on basics mechanisms of epigenetic inheritance mediated by TFs in stem cells.Outro - CENTRO-01-0145-FEDER-0300132019-09-172025-09-15T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/88010http://hdl.handle.net/10316/88010TID:202305163engSilva, Catarina Milheiro Soares dainfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-10-27T10:54:43Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/88010Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:08:48.841535Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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