Identificação in silico e validação experimental de novos fármacos inibidores de efluxo ou biofilmes em Staphylococcus aureus

• Autor(a) principal: ANTUNES, Carolina Jorge
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/159134
• topic: Microbiologia médica; Staphylococcus aureus; Resistência a antibióticos; Efluxo; Biofilmes; Reposicionamento de fármacos; Biologia molecular; Saúde tropical e internacional-saúde pública; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

Staphylococcus aureus é agente de uma vasta gama de infeções, de fraca severidade até potencialmente fatais. A emergência de estirpes resistentes aos antibióticos, particularmente S. aureus resistente à meticilina (MRSA), é preocupante devido às limitadas opções terapêuticas. Neste trabalho, foi utilizada uma estratégia de reposicionamento de fármacos baseada em quimiogenómica para a identificação de novos fármacos que possam atuar em dois mecanismos associados à resistência aos antimicrobianos em S. aureus, o efluxo e a formação de biofilmes. Esta estratégia consiste na pesquisa in silico de potenciais inibidores de efluxo (IE) e/ou agentes antibiofilmes que são depois sujeitos a um algoritmo experimental para validar a sua atividade biológica. Compilou-se informação sobre transportadores membranares de S. aureus (na base de dados “TransportDB”) e proteínas associadas à formação de biofilmes (no repositório “UniProt”), gerando uma lista de potenciais alvos. Estes alvos foram usados para interrogar a base de dados “DrugBank”, que compila informação sobre fármacos aprovados pela FDA, fármacos investigacionais e experimentais, e os seus respetivos alvos. Este processo gerou uma lista de alvos homólogos aos de S. aureus e uma lista de fármacos (n = 826) associados. Aplicando vários critérios de exclusão, obteve-se uma lista curada de fármacos candidatos (n = 243) com potencial atividade no efluxo e/ou biofilmes em S. aureus. Foram escolhidos sete fármacos, pertencentes às duas superclasses químicas mais representativas para validação experimental: desipramina, cloroquina, atovaquone, topiramato, amlodipina, tariquidar e sulpirida. O modelo experimental incluiu as estirpes MRSA COL, S. aureus ATCC25923 e sua derivada ATCC25923_EtBr adaptada ao brometo de etídio, que sobreexpressa o gene norA que codifica para NorA, uma das principais bombas de efluxo em S. aureus. Os fármacos candidatos foram comparados com os IE controlo tioridazina, clorpromazina, verapamil e reserpina. A concentração mínima inibitória (CMI) dos fármacos/IE controlo foram determinadas por microdiluição. Depois, cada fármaco/IE controlo foi avaliado quanto à sua capacidade de, em concentração subinibitória, reduzir significativamente (≥4x) a CMI de um painel de compostos antimicrobianos, que incluem substratos e não substratos de NorA. Os fármacos que apresentaram efeito significativo foram avaliados quanto ao sinergismo com diferentes antimicrobianos por ensaios de checkerboard e quanto ao seu potencial de inibição da formação de biofilme pelo método de adesão em placa com violeta de cristal. Todos os fármacos candidatos testados mostraram uma CMI elevada (>64 mg/L) contra as estirpes de S. aureus. Os fármacos tariquidar, amlodipina, desipramina e cloroquina (ordenados pela maior atividade) reduziram a CMI de todos ou alguns substratos de NorA em ATCC25923_EtBr, sugerindo que possuem atividade inibitória de efluxo. Os ensaios de checkerboard mostraram que o tariquidar a 1/32x CMI (8 mg/L) e a amlodipina a 1/16x CMI (4 mg/L) apresentam sinergismo com substratos de NorA. Testes adicionais mostraram que apenas a amlodipina é capaz de abolir a formação de biofilme a ½ CMI (64 mg/L), um efeito menor do que o observado para verapamil e tioridazina. Os nossos resultados evidenciam a amlodipina como o único fármaco candidato que apresentou atividade quer a nível de inibição do efluxo quer na formação de biofilmes. No entanto, o tariquidar foi o que apresentou maior atividade inibitória de efluxo, quando comparado com IEs controlo e outros fármacos candidatos. Estudos adicionais poderão elucidar os mecanismos de ação destes fármacos, particularmente a associação efluxo biofilme e amlodipina. Em suma, este trabalho destaca a utilidade do reposicionamento de fármacos para identificar novos fármacos que visam o efluxo e/ou produção de biofilme em S. aureus, revelando a amlodipina como um novo potencial fármaco de duplo alvo e o tariquidar como um potente IE, os quais podem no futuro ser explorados no combate às infeções por S. aureus resistentes a antimicrobianos.