Production and characterization of the fusion ZZapo-CBM64 for the capture and detection of apolipoprotein-A1 in paper tests

• Autor(a) principal: Barbosa, Luís Miguel Marques
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/22709
• topic: Bioquímica; Imunoglobulinas; Microfluídica; Proteínas - Afinidade

Affibodies (ZZ) são pequenas proteínas de afinidade que podem ser modificadas para se ligarem a alvos específicos. Estas proteínas têm sido sugeridas como uma alternativa a anticorpos, devido ao seu processo de produção mais simples e barato. Assim, o objetivo deste trabalho de mestrado visou a possibilidade da utilização de um affibody (ZZapo) para a captura da Apolipoproteina-A1 (Apo-A1) e sua deteção com anticorpos Anti-Apo-A1 conjugados com Nanopartículas de Ouro (AuNPs) num Dispositivo Microfluídico Analítico de Papel (μPAD). Para atingir o objetivo proposto, a fusão de uma molécula com afinidade a carboidratos da família 64 (CBM64) com o affibody ZZapo (ZZapo-CBM64) foi desenhada, produzida em E.coli, sequenciada, purificada e quantificada com sucesso. A fusão ZZapo-CBM64 foi comparada com a fusão semelhante ZZ-CBM64, que tem afinidade para imunoglobulina G (IgG). Foi testada a capacidade de ligação das fusões à celulose, tendo-se verificado que ambas apresentaram alta afinidade a micropartículas e papel de celulose. Foi ainda testada a capacidade de ligação das duas fusões a IgG, pela utilização de IgG marcado com fluorescência. No entanto, ao contrário da ZZ-CBM64, a ZZapo-CBM64 não mostrou afinidade para a IgG. Um teste μPAD foi criado com barreiras impressas a cera hidrofóbica, e com um adesivo na base do teste, o que permitiu os testes serem feitos em superfícies planas e ainda contribuiu para um fluxo da amostra mais rápido. Os testes μPAD mostraram interações não específicas entre ZZapo-CBM64 e AuNPs, que foram removidas pela conjugação das AuNPs com Albumina de Soro Bovino (BSA) e adição de BSA e Tween20 à solução tampão. Os testes μPAD para deteção da Apo-A1 mostraram interações não específicas entre Apo-A1 e a membrana adesiva, que foram removidas pela utilização de um tampão de Bicarbonato de Amónia com BSA e Tween20. A deteção de Apo-A1 em μPADs não foi conseguida devido ao ZZapo-CBM64 não capturar a Apo-A1. Esta falha poderá ser devido a algum bloqueio da zona de captura relacionado com a estrutura 3D da fusão. De modo a ultrapassar esta questão, deverão ser realizados trabalhos futuros para o estudo da estrutura 3D da fusão, assim como estudo de outras fusões com diferentes variantes de affibodies para averiguar se o problema é exclusivo à fusão ZZapo-CBM64 ou não.