Biotechnological approaches for yield improvement of anticancer alkaloids in the plant Catharanthus roseus

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Fernandes, Bernardete Sofia da Cruz
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1822/39715
Resumo: Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas
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spelling Biotechnological approaches for yield improvement of anticancer alkaloids in the plant Catharanthus roseusAbordagens biotecnológicas para a melhoria do rendimento dos alcaloides anticancerígenos presentes na planta Catharanthus roseusCiências Naturais::Ciências BiológicasDissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em PlantasCatharanthus roseus (L.) G. Don produces an impressive number of specialized metabolites, over 130 terpenoid indole alkaloids (TIAs), among which the anticancer vinblastine (VLB) and vincristine (VCR). VLB and VCR were the first natural drugs used in cancer therapy, still holding an important position in the treatment of cancer nowadays. VLB and VCR accumulate in very low levels in C. roseus leaves that remain the only source of the anticancer TIAs, since efforts to obtain their entire chemical synthesis have been unfruitful. An intense research has been carried out over the last decades in C. roseus to unveil the biosynthesis of TIAs pathway, however, the characterization of several biosynthetic steps is still missing, and the membrane transport mechanisms are basically uncharacterized despite their importance for TIA accumulation. Previous studies, in our group, allowed the identification of a number of very strong candidates to important functions within the TIA pathway, including MATE1, a strong candidate to TIA vacuolar accumulation, and CYP2, a strong candidate to two of the last steps of VLB and VCR biosynthesis. These genes are strong candidates for the possible manipulation of TIA levels in order to improve their accumulation. The work developed here includes the sub-cloning of each gene into a plant binary vector followed by the genetic transformation of C. roseus hypocotyls using Agrobaterium tumefaciens. The induction of transgenic callus was optimized, leading to the successful establishment of transgenic callus lines confirmed by performing a Gus assay. The regeneration into a whole plant was actively pursued by changing an array of conditions but remained unsuccessful. Complementarily, downregulation of MATE1 expression was carried out using Virus Inducing Silencing Gene (VIGS), by sub-cloning a specific MATE1 fragment into a viral based plant vector followed by Agrobacterium mediated transformation of C. roseus plants. The putatively silenced plants showed significantly lower levels of the major alkaloids accumulated in C. roseus leaves, strongly supporting a role of MATE1 in their transtonoplast transport. Overall, the work developed gives a significant contribution to the possibility of performing future biotechnological improvements of C. roseus for increased levels of the anticancer VLB and VCR.Catharanthus roseus (L.) G. Don produz um número impressionante de metabolitos secundários, mais de 130 alcalóides terpenóides indólicos (TIA), entre os quais, os anticancerígenos vinblastina (VLB) e vincristina (VCR). VLB e VCR foram os primeiros medicamentos de origem natural a serem utilizados no tratamento do cancro, mantendo ainda hoje uma posição relevante na terapia do cancro. VLB e VCR acumulam-se em níveis muito baixos nas folhas de C. roseus, que permanecem como a única fonte dos anticancerígenos, uma vez que, os esforços para os obter integralmente por síntese química têm sido infrutíferos. Ao longo das últimas décadas, C. roseus tem sido intensamente investigada com o intuito de desvendar a via de síntese dos TIA, no entanto, várias etapas ainda estão por caracterizar assim como os mecanismos de transporte membranar, apesar da sua importância para a acumulação dos TIAs. Estudos anteriores, no nosso grupo, possibilitaram a identificação de genes candidatos a funções importantes dentro da via dos TIAs, incluindo MATE1 um forte candidato ao transporte dos TIAs para o vacúolo, e CYP2, um forte candidato a intervir num dos dois últimos passos da biossíntese de VLB e VCR. Estes genes são fortes candidatos para uma eventual manipulação dos níveis de TIA, a fim de aumentar a sua acumulação. O presente trabalho inclui a sub-clonagem de cada um dos genes num vetor binário seguido pela transformação genética dos hipocótilos de C. roseus usando Agrobacterium tumefaciens. A indução de callus transgénico foi otimizada, alcançando-se com sucesso linhas de calli transgénicas, confirmadas através da realização de um ensaio de GUS. A regeneração para obter a planta foi arduamente perseguida alterando-se uma série de condições, mas até ao momento não foi alcançada. Complementarmente, o silenciamento da expressão do gene MATE1 foi levado a cabo usando Vírus Indutor de silenciamento do gene (VIGS), através da sub-clonagem de um fragmento específico de MATE1 num vetor viral modificado, seguindo-se a transformação das plantas mediada por Agrobacterium. As plantas putativamente silenciadas apresentaram níveis significativamente mais baixos dos principais alcalóides acumulados em folhas de C. roseus, reforçando fortemente o papel do MATE1 no seu transporte. No geral, o trabalho desenvolvido contribui significativamente para a possibilidade de no futuro realizarem-se melhorias biotecnológicas em C. roseus com vista a aumentar os níveis dos anticancerígenos VLB e VLC.Sottomayor, MarianaGerós, H.Universidade do MinhoFernandes, Bernardete Sofia da Cruz20152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/1822/39715eng201258340info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-10-07T01:22:00Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/39715Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:34:29.602551Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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