Optimization of the differentiation process of umbilical cord matrix mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Alexandra Martins de Medeiros Vieira da
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/10492
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
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spelling Optimization of the differentiation process of umbilical cord matrix mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cellsDiferenciação celularCélulas estaminaisCordão umbilicalHepatócitosTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013The few literature described protocols of hepatic differentiation of human umbilical cord matrix mesenchymal stem cells (ucmMSC) lead to populations of cells with less than satisfactory differentiation rates. In this study a hepatic differentiation protocol was firstly optimized in conventional monolayer (2D) cultures and further implemented in a 3D culture method, in order to achieve a homogenous population of functional hepatocyte-like cells (HLCs), as part of the creation of an alternative model for in vitro toxicology studies. UCXR, ucmMSC isolated by a proprietary method developed by ECBio S.A., were subjected to 4 differentiation protocols in 2D culture conditions being the most promising procedure applied to 3D culture method. The characterization of differentiated UCXR included the analysis of the expression of hepatic markers by quantitative real time reverse--‐transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) and immunofluorescence assays. Metabolic activity was assessed through ECOD and UGT activity assay, and also by glycogen accumulation and urea production. Undifferentiated UCXR, HepG2 and primary rat hepatocytes were used as controls. The HLCs that resulted from the optimized protocol showed hepatocyte-like morphology, expression of hepatic lineage markers, including ALB, CK18 and HNF4α as well as the underexpression of CK19. These also exhibited biotransformation activity (ECOD and UGT activities), and the ability to store glycogen and to produce urea. When transposed into 3D cultures, the optimized method induced the expression of hepatic markers CK18, HNF4α and ALB and higher urea production. In summary a more homogenous and functional population of HLCs, with hepatocyte expression pattern and metabolic activity at a superior level than HepG2 and in some aspects at the same activity level of rat primary hepatocytes, was successfully obtained, opening doors to the construction of a humanly-close metabolism and toxicology model for drug testing.O fígado é o maior órgão interno do corpo humano, sendo este constituído por células parenquimatosas e não parenquimatosas. No grupo das células parenquimatosas, incluem-se os hepatócitos, que constituem 60% a 70% do número total de células do fígado. As células endoteliais, células de Kupffer, células de ito e células estaminais (células ovais) são as células não parenquimatosas do fígado [1-2]. O fígado desempenha funções muito importantes no organismo, nomeadamente, o armazenamento e processamento dos nutrientes, produção de proteínas plasmáticas e destoxificação do organismo através da alteração da estrutura de moléculas ou através da excreção pela bílis [2]. O ciclo da ureia é o principal processo de destoxificação do sangue, responsável pela conversão de amónia em ureia, sendo esta depois filtrada e excretada pelos rins [2] . O fígado é também o principal órgão responsável pela biotransformação. Os hepatócitos expressam enzimas de biotransformação de fase I e fase II: os citocromos P450, enzimas de fase I responsáveis pelas vias de oxidação, redução e hidrólise que adicionam ou expõem um grupo funcional, como hidroxilo, tiol, ou amina ao substrato. As reações de fase II conduzem à formação de conjugados desses mesmos grupos funcionais com ácido glucurónico, sulfato e glutationa, que levam à eliminação directa (no caso dos dois primeiros) e destoxificação (no caso da conjugação com glutationa) das moléculas metabolizadas [3]. Sendo o fígado o principal órgão de metabolização de xenobióticos, este é mais exposto aos efeitos potencialmente tóxicos dos fármacos e seus metabolitos. Para detectar precocemente os potenciais riscos toxicológicos é essencial ter bons modelos in vitro de teste de fármacos antes de estes entrarem em ensaios clínicos [4]. Vários modelos in vitro são usados em estudos de toxicologia, por exemplo: bactérias ou vírus modificados geneticamente para expressarem isoformas de enzimas de fase I e fase II [5-6], fígados isolados [1, 7], culturas primárias de hepatócitos [1, 8] e linhas celulares [9-10]. Modelos baseados na perfusão do fígado, tanto in vivo com ex vivo, são muito utilizados para testar o metabolismo hepático e farmacocinética. Estes modelos têm a capacidade de manter a estrutura hepática intacta, todavia a complexidade do mesmo dificulta a compreensão dos processos que ocorrem a nível intracelular [1, 7]. Os modelos celulares mais utilizados baseiam-se em linhas celulares de carcinoma hepatocelular, como HepG2 e HepRG [9-10]. HepG2 é uma linha celular humana acessível, fácil de manter em cultura. Todavia, não apresenta algumas funções características dos hepatócitos, como por exemplo, apresenta um perfil de expressão de enzimas de biotransformação diferente [10]. Recentemente, foi isolada e caracterizada a linha celular-HepRG. Estas células encontram-se num estado bipotente semelhante ao de hepatoblasto e a sua maturação pode ser induzida através da adição de 2% dimetil sulfóxido (DMSO) e 50 11M hidrocortisona. Quando maturadas, estas células expressam 85% dos genes expressos em hepatócitos humanos. Contudo, muitos marcadores importantes não são expressos, como é o caso dos factores de transcrição C/EBPa, C/EBPj) e enzimas de fase II [9]. Os hepatócitos primários, são um modelo de excelência para a compreensão de processos metabólicos e efeitos hepatotóxicos de fármacos [1, 11], dado que durante um período de tempo após o seu isolamento, preservam muitas das funções hepáticas, como a capacidade de biotransformação, metabolismo de glucose e destoxificação da amónia. Apesar disso, a dificuldade em obter material biológico traduz-se na difícil implementação deste sistema de forma contínua e prolongada [1]. O uso de hepatócitos primários de rato é mais acessível, porém existem diferenças interespécies que não permitem a total correlação entre este modelo e o fígado humano in vivo. Além de que, a perda de funcionalidade persiste, problema inerente a todos os hepatócitos primários [12-13] . Tendo em consideração os problemas éticos e diferenças interespecies mencionados, um novo método foi proposto como alternativa para substituir as culturas de hepatócitos primários nos ensaios de toxicologia, que se baseia na utilização de hepatócitos obtidos por diferenciação de células estaminais humanas [1,4, 14]. Os protocolos de diferenciação em hepatócitos são alicerçados nos 4 passos do desenvolvimento do fígado: indução da formação da endoderme, indução da competência hepática, formação de hepatoblastos e finalmente maturação em hepatócitos [15]. Como ponto de partida para esta diferenciação já foram testados diferentes tipos de células: células estaminais embrionárias [16-19], células mesenquimais da medula óssea [20-21], adipócitos [22], e células estaminais pluripotentes induzidas [23-24]. Todavia os estudos que utilizam células esta minais mesenquimais do cordão umbilical para esta finalidade, são escassos [25]. O cordão umbilical é uma fonte muito vantajosa de células estaminais mesenquimais visto que permite um isolamento inicial rápido de um grande número de células multi potentes e a sua utilização levanta muito menos problemas éticos [26-27]. Os sistemas de cultura em monocamada (2D) são muito utilizados para a cultura in vitro de hepatócitos. Este tipo de cultura obriga os hepatócitos a adquirirem uma morfologia achatada que não corresponde à que possuem no ambiente in vivo [1-2]. Recentemente, têm-se vindo a abordar modelos de cultura em 3D. São vários os métodos que se podem aplicar, entre os quais se destaca o método de formação de agregados [28]. Esta técnica assenta sobre a capacidade inata que algumas células têm em se agregar, permitindo a formação de matriz extracelular natural, de extrema importância na manutenção das funções dos hepatócitos [1]. Neste sentido, o objectivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo para diferenciação de células mesenquimais estaminais da matriz do cordão umbilical (UCX®) em hepatócitos maduros com a finalidade de se criarem modelos de toxicologia. Com o intuito de se obter uma população homogénea e funcional de hepatócitos, algo não alcançado em estudos anteriores, novos protocolos foram testados e implementados em modelos 3D que permitem reproduzir melhor o ambiente in vivo, logo, tendo um grande potencial para aumentar o sucesso da diferenciação em hepatócitos. Nas UCX® diferenciadas foi analisada a expressão de marcadores hepáticos CK18, ALB e HNF4a por qRT-PCR e imunofluorescência. A atividade de biotransformação foi determinada através dos ensaios de atividade ECOO e UGT. Também foi avaliada a capacidade de acumulação do glicogénio através do método PAS e a capacidade de destoxificação da amónia, foi determinada a partir da quantificação da ureia produzida. HepG2 e hepatócitos primários de rato foram usados como controlo. Primeiramente, foi implementado o protocolo descrito por Campard et aI. (2008), uma vez que este foi aplicado a MSCs da matriz do cordão, para o nosso conhecimento o único. Utilizando este protocolo como base, modificações foram feitas nos 3 passos que o constituem. O protocolo optimizado permitiu a obtenção de hepatócitos com expressão dos marcadores hepáticos CK18, HNF4a e ALB com níveis de função superiores a HepG2 e em alguns ensaios ao mesmo nível que os hepatócitos primários de rato. O protocolo optimizado em 20 foi testado em 30, na medida em que este método permite que as células adquiram uma estrutura mais semelhante ao que acontece in vivo e os hepatócitos diferenciados foram caracterizados no que respeita a morfologia, através de coloração com hematoxilina eosina, detecção de marcadores hepáticos CK18, HNF4a e ALB através de imunofluorescência, acumulação de glicogénio através de coloração PAS e produção de ureia. Os resultados obtidos demonstram uma clara melhoria em termos de presença dos marcadores hepáticos (CK18, HNF4a e ALB) relativamente às células diferenciadas em 20 com o mesmo protocolo. Em relação à atividade metabólica, as células diferenciadas em cultura 3D, apresentam maior competência em termos de metabolismo de glucose (PAS) e destoxificação de amónia, o que confirma o potencial das culturas em 3D no que respeita à diferenciação e obtenção de hepatócitos funcionais.Miranda, JoanaRodrigues, Maria Gabriela, 1965-Repositório da Universidade de LisboaSilva, Alexandra Martins de Medeiros Vieira da2014-02-10T15:18:11Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/10492TID:201337312enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:56:01Zoai:repositorio.ul.pt:10451/10492Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:34:30.021367Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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