Monitoring the activity of the Notch pathway in neural progenitor cells
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|---|---|
| Data de Publicação: | 2011 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/8430 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 |
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Monitoring the activity of the Notch pathway in neural progenitor cellsBiologia molecularCélulas estaminaisTubo neuralNeurogéneseProteínasTeses de mestrado - 2011Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Neural progenitor (NP) cells proliferate in the ventricular zone (VZ) of the neural tube and migrate towards the mantle layer (ML) upon neural differentiation. In order to produce the correct type and number of neurons at the right time, a precise control of the proliferation of neural progenitor (NP) cells and their differentiation is required. The Notch signaling pathway, through lateral inhibition, is involved in this balance, restraining NP differentiation. However, not much is known about Notch activity in single NPs, mainly regarding possible variations on Notch activity in each NP, and how this putative dynamic activity contributes to the maintenance of these cells in the undifferentiated state. In order to answer these questions, I used several ES cell lines expressing different reporters of Notch activity driven by the promoter of the Hes5 gene. These ES cells can be directed to neural differentiation in adherent monolayer cultures, resulting in the production of neuroepithelial rosettes that mimic their in vivo counterpart, the neural tube. Here, I show that an already described Hes5::GFP reporter ES cell line is not suitable to be used as a reporter of Notch activity since the half-life of the reporter protein is much longer than that of the HES5 protein, not allowing the detection of the termination of Notch activity. I also test other ES cell lines, Hes5::VNP, that express an unstable reporter protein, which might allow a more precise and accurate monitoring of Notch activity dynamics. Using this cell lines, I could observe that not all cells in neuroepithelial rosettes express the reporter protein, and that the levels of Notch activity are variable between NPs. Further engineering of these cell lines needs to be performed in order to be able to construct a double reporter cell line carrying a reporter of Notch activity together with a reporter of neuronal differentiation to allow visualization of differentiated neurons.O tubo neural, estrutura embrionária que no adulto origina o sistema nervoso central, encontra-se organizado em duas zonas: a zona ventricular, onde residem os progenitores neurais, e a zona do manto, para onde migram estas células quando começam a diferenciar em neurónios. Os núcleos dos progenitores neurais movimentam-se entre as regiões apical e basal da zona ventricular num mecanismo designado de movimento intercinético nuclear. Este movimento encontra-se relacionado com as fases do ciclo celular, sendo que a mitose ocorre quando o núcleo dos progenitores neurais se encontra na região apical e a fase S quando este se encontra na região basal. Durante a neurogénese é necessária a existência de um controlo preciso entre a manutenção de células num estado indiferenciado e a diferenciação destes progenitores em células neurais. Sabe-se que a via de sinalização Notch está implicada neste balanço através do processo de inibição lateral, restringindo a diferenciação das células progenitoras. Inicialmente todas as células expressam níveis semelhantes de ligandos Notch e genes pró-neurais. Contudo, devido a variações estocásticas, uma das células começa a expressar níveis mais elevados de ligandos Notch e consequentemente é mais eficiente na activação de Notch nas células vizinhas. Nas células em que Notch é activado há expressão de genes Hes que reprimem a expressão de genes pró-neurais e levam à consequente manutenção dessas células como progenitores neurais. Por sua vez, nas células que não activaram Notch ocorre a expressão de genes pró-neurais com consequente diferenciação dos progenitores neurais. Após a migração dos neurónios nascentes para a zona do manto, estas células deixam de sinalizar para as células adjacentes. Desta forma a actividade de Notch diminui nos progenitores neurais vizinhos e o processo de inibição lateral poderá ser reiniciado. Assim, os níveis de Notch em progenitores neurais não deverão ser constantes e a sinalização Notch será dinâmica. A actividade dinâmica da via de sinalização Notch foi monitorizada na mesoderme pré-somítica e em culturas de progenitores neurais isolados utilizando uma proteína reporter instável sob o controlo do promotor de um gene alvo de Notch: Hes1. A utilização deste repórter permitiu observar variações na expressão de Hes1. Contudo, foi observado que a expressão de Hes1 não é apenas dependente da actividade da via Notch, respondendo a outras vias de sinalização como a via Jak/Stat, o que impossibilita a monitorização apenas da actividade da via de sinalização Notch. Uma outra observação concordante com a actividade dinâmica de Notch é a expressão de componentes da via Notch em gradientes entre as regiões apical e basal da zona ventricular, sugerindo que nos progenitores neurais a activação de Notch é específica de determinadas fases do ciclo celular. Em retina de peixe zebra foi observado que o receptor Notch activado é expresso em níveis elevados na região apical, onde os progenitores se encontram nas fases G2/M/G1 do ciclo celular. Contudo, em cérebro de ratinho o receptor Notch activado foi detectado em células em fase S do ciclo celular e não em mitose. No tubo neural de galinha o mRNA de Notch foi detectado na região apical da zona ventricular, onde ocorre a mitose. Estes resultados contraditórios podem indicar regulações diferentes da actividade Notch em diferentes organismos e tecidos. Desta forma, uma análise mais profunda é necessária para determinar se a activação de Notch ocorre especificamente em determinadas fases do ciclo celular. Por outro lado é necessária a análise de progenitores neurais ao nível de células individuais recorrendo a um repórter que responda apenas a Notch. Apenas desta forma será possível determinar se Notch pode ser activado mais do que uma vez no tempo de vida de cada progenitor neural e se a sua actividade é necessária para manter estes progenitores neurais num estado indiferenciado. Neste trabalho utilizaram-se várias linhas celulares de células estaminais embrionárias (Hes5::GFP and Hes5::VNP) que expressam diferentes proteínas repórter sob o controlo do promotor do gene Hes5, que se pensa ser o principal alvo da via Notch no sistema nervoso central. Estas células estaminais embrionárias podem ser diferenciadas em tecido neural, através de um protocolo de cultura de células aderentes em monocamada, formando estruturas características designadas rosetas neuroepiteliais, onde a expressão de Hes5 foi já documentada. A linha celular Hes5::GFP já tinha sido descrita e foi testada relativamente às suas capacidades de auto-renovação e pluripotência tendo-se observado que não diferia da linha celular controlo. Adicionalmente, a sua capacidade de diferenciação neural e a expressão da proteína repórter foram testadas tendo-se confirmado a capacidade de originar rosetas neuroepiteliais em que a expressão da proteína repórter estava presente. O tempo de semi-vida da proteína repórter foi determinado de forma a avaliar se esta linha celular iria permitir a monitorização e determinação do início e terminação da actividade da via Notch. Observou-se que 12 horas após o bloqueio da tradução as células ainda exprimem cerca de 75% do valor inicial de proteína repórter GFP. Dado que o tempo de semi-vida da proteína HES5 é de aproximadamente 1 hora foi possível concluir que esta linha repórter não pode ser usada para monitorizar a actividade Notch uma vez que permanece nas células durante muito tempo após a sua terminação. Foram geradas no Laboratório linhas celulares que expressam uma proteína repórter instável sob controlo do promotor do gene Hes5 de forma a possibilitar a detecção do começo e terminação da actividade Notch. Estas linhas foram validadas em termos de capacidade de auto-renovação e pluripotência tendo-se observado que as suas características não diferiam daquelas da linha celular controlo. Adicionalmente, foi confirmada a capacidade de formação de rosetas neuroepiteliais e expressão da proteína repórter. Das linhas geradas a linha Hd foi escolhida para continuar as experiências tendo-se observado que a intensidade de expressão do repórter não é igual em todas as células das rosetas originadas por estas células. Este resultado sugere que a intensidade da actividade Notch varia entre os progenitores neurais. Este facto pode ser explicado pelo facto de a expressão de Notch ser constante em cada célula mas variar entre diferentes células, ou pelo facto de esta expressão ter variações na mesma célula. De realçar ainda que estes resultados sugerem possíveis flutuações na actividade da via Notch, enfatizando a importância da monitorização de Notch ao nível de um único progenitor neural. A linha celular Hd, possui a sequência do gene de resistência à Neomicina localizada entre a região codificante da proteína VNP e a região 3‟UTR do gene Hes5, onde se localiza o sinal de poli-adenilação necessário para a produção de um transcrito com todos os sinais de regulação pós-transcricional necessários. Desta forma procedeu-se à remoção do gene de resistência à Neomicina de forma a assegurar a correcta expressão da proteína repórter. Contudo, nas linhas celulares obtidas após este procedimento não se observou expressão da proteína reporter. Após vários testes à sequência promotora e à expressão do repórter ao nível de mRNA e proteína concluiu-se que a falta de expressão do repórter deveria dever-se a problemas a nível da transcrição. De forma a ultrapassar estes constrangimentos novas linhas celulares deverão ser desenhadas e geradas de forma a que o cDNA da proteína reporter possua o seu próprio sinal de poliadenilação antes de se proceder à remoção da cassete de selecção. Desta forma a expressão da proteína repórter poderia ser analisada imediatamente aquando da geração das linhas sem serem necessários procedimentos adicionais de remoção da cassette de selecção, que acarretam a possibilidade de introdução de instabilidade genómica e danos no DNA. Após a construção de linhas Hes5::VNP capazes de monitorizar de forma fiel a actividade da via Notch será possível monitorizar esta actividade em progenitores neurais ao nível de células individuais. Assim será possível determinar se Notch pode ser activado várias vezes ao longo do tempo de vida destas células e especificamente em determinadas fases do ciclo celular e se essa activação está correlacionada com a manutenção das células num estado indiferenciado. Adicionalmente, estas linhas celulares podem ser usadas para a formação de uma dupla linha repórter que expressa repórteres da actividade Notch e também de diferenciação. Desta forma será possível avaliar não só as variações na actividade da via Notch mas também diferenciação neuronal, correlacionando a actividade Notch com o destino celular dos progenitores neurais.Henrique, Domingos, 1960-Gomes, Rui Artur Paiva Loureiro, 1958-Repositório da Universidade de LisboaGuedes, Ana Marisa Mendes Gonçalves Vinhais, 1987-2013-05-10T13:44:30Z20112011-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/8430enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:52:18Zoai:repositorio.ul.pt:10451/8430Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:32:58.804204Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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