Novas estratégias de purificação de RNAs usando líquidos iónicos

• Autor(a) principal: Martins, João Carlos Claudino
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/6642
• topic: Ácidos Nucleicos; Cromatografia; Líquidos Iónicos; Rna; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia:: Biotecnologia

As terapia baseadas em RNA têm emergido como estratégias promissoras no tratamento de diversas doenças, como cancro, doenças autoimunes e neuro-degenerativas. Contudo, o estabelecimento de terapias com base no RNA requer a preparação de elevada quantidade de RNA mantendo a sua integridade, pureza e atividade biológica. Este é o maior objetivo do uso de metodologias de purificação de RNA. Os líquidos iónicos (LI) são um grupo de sais orgânicos de variada estrutura, com grande versatilidade para manipular o design de catião/anião e apresentam características físico-químicas particulares. Mais ainda, alguns LIs conseguem o estatuto de solventes “green” e têm sido observados como uma alternativa aos solventes orgânicos usados num vasto leque de aplicações. O principal objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de novas matrizes superporosas funcionalizadas com ILs para cromatografia liquida preparativa com a purificação de RNA em vista. Diferentes LIs foram ligados covalentemente em sílica (S-Sil), usada como fase estacionária, para avaliação inicial das interações dos ILs com o RNA. Esta técnica revela ser reprodutível e mais económica para a pré-avaliação antes de usar uma coluna cromatográfica. A capacidade de diferentes tipos de S-Sils (SilPrMImCl; SilPrMImArg; SilPrPyCl; SilPrArgCl; SilPrBenzCl; SilPrNEt3Cl; SilPrN(C8)3Cl; SilPrLyCl) para reconhecer e ligar ao RNA foi avaliada em modo batch e, de seguida, foram realizados diferentes testes de modo a provar a reprodutibilidade, a robustez e a resistência à regeneração. Em geral, os S-Sils mostraram a possibilidade de promover múltiplas interações incluindo hidrofóbicas, iónicas, pontes de hidrogénio e interações dipolo-dipolo com o RNA. Em particular, S-SilPrMImCl, S-SilPrNEt3Cl e S-SilPrMet2ButCl mostram ser ligandos promissores para aplicação na purificação do RNA. Inicialmente foi realizada a funcionalização da matriz cromatográfica Sp-SilPrMImCl e, após confirmação da funcionalização, foram realizados ensaios de purificação de RNA a partir de lisados de E. coli. Neste estudo foi confirmada a completa separação entre o RNA e o DNA num único passo cromatográfico. Foi ainda avaliada a reprodutibilidade da coluna onde é visível a separação do RNA sem contaminação. O novo suporte demonstrou ainda apresentar ainda uma elevada capacidade de ligação dinâmica comprovando assim a robustez da matriz para purificar uma grande quantidade de amostra, considerando até a potencial aplicação na purificação de vários tipos de biomoléculas.