Signaling pathways involved in the modulation of microglial reactivity by the action of GDNF

• Autor(a) principal: Garcia, Paulo Ricardo Medeiros
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/2070
• topic: Microglia; Doença neurodegenerativa

Os processos inflamatórios, que ocorrem no sistema nervoso central (SNC), mediados pela activação das células da glia desempenham um papel importante na morte neuronal e estão associados ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (DP). As células da microglia são células do sistema imunitário inato residentes no SNC e constituem a primeira linha de defesa quando ocorre um dano ou mesmo uma doença. Uma lesão no SNC promove a rápida activação da microglia. Por sua vez a microglia contribui para o processo neurodegenerativo através da libertação de uma variedade de factores neurotóxicos (citocinas pró-inflamatórias, espécies reactivas de oxigénio e nitrogénio) que promovem a degeneração dos neurónios. Contudo, o processo inflamatório, quando não exacerbado, é benéfico por contribuir para a libertação de factores neurotróficos, que contrariam o dano neuronal. O factor neurotrófico derivado de células da glia (GDNF) é um potente factor que promove a sobrevivência de diferentes populações neuronais, em diferentes regiões do cérebro e com grande potencial terapêutico para a DP. Apesar do seu efeito na microglia estar pouco estudado, existem alguns resultados que indicam que o GDNF é capaz de regular a actividade destas células. Trabalhos anteriores do nosso laboratório (Rocha et al. 2011) demonstraram que o GDNF secretado pelos astrócitos tem a capacidade de impedir a activação microglial induzida pelo Zymosan A, um polissacarídeo extraído da parede de leveduras e que actua via receptores Toll-like receptor 2 (TLR2). Com este trabalho pretendemos aprofundar este efeito tentando esclarecer quais as vias de sinalização usadas pelo GDNF para modular a activação microglial e assim regular a neuroinflamação. Para a determinação do efeito do GDNF na actividade da microglia, culturas primárias de microglia foram previamente expostas ao meio condicionado de astrócitos (MCA, no qual está presente GDNF secretado pelos astrócitos), posteriormente, estimuladas com Zymosan A ou com LPS. A actividade da microglia foi quantificada através da produção de espécies reactivas de oxigénio, de óxido nitríco ou por determinação da actividade fagocítica. O objectivo inicial deste trabalho era o de determinar as vias de transdução de sinal usadas pelo GDNF para regular a actividade da microglia. Contudo, as primeiras experiências realizadas mostraram uma inesperada falta de resposta da cultura de microglia aos agentes inflamatórios LPS e Zymosan A, quando a reactividade foi analisada através da produção de ROS por uma técnica fluorimétrica que mede as ROS produzidas por uma população de células. Esta falta de resposta deve-se provavelmente ao facto de os sinais na população total serem baixos e de a técnica usada para detectar essas alterações ser pouco sensível. Quando a reactividade microglial induzida pelos agentes inflamatórios foi analisada por medição da actividade fagocítica da microglia, através de uma técnica de microscopia de fluorescência, os resultados foram mais robustos, provavelmente por esta ser uma técnica em que se procede a uma análise célula a célula evitando que alguns efeitos sejam camuflados pela população total. Por outro lado os resultados obtidos mostraram também que a microglia isolada pelo método de tripsinização nunca adquiriu uma morfologia típica de um estado de repouso mesmo após mais de um mês em cultura. Esta aparente maior reactividade basal das células pode ser uma das causas dos fracos sinais detectados quando estas são estimuladas com agentes inflamatórios. Assim, constatou-se, que os níveis de produção de ROS e NO não foram significativos, quando usado o LPS (1 μg/μL) ou o ZyA (5 μg/mL), como agentes inflamatórios, no entanto estes estímulos foram capazes de aumentar significativamente a actividade fagocítica e quer o MCA quer a adição de GDNE exógeno foram capazes de reverter estes aumentos. Assim, podemos afirmar que os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que o GDNF tem, efectivamente, a capacidade de modular a resposta fagocítica da microglia e que a via de sinalização – p38 – está envolvida no processo de regulação da activação da microglia pelo MCA. No entanto é necessário testar a acção do inibidor da p38 na presença de GDNF exógeno para confirmar que esta via está envolvida no processo de regulação da activação da microglia pelo GDNF.