Porphyrins analysis in biological fluids: development and application of different methodologies

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Fernandes, Joana Filipa Cabral Vargas
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/31205
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
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spelling Porphyrins analysis in biological fluids: development and application of different methodologiesPorfirinasConservação de amostras de urinaAnálise de porfirinas na urinaMetais pesadosBiomarcadoresTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A exposição a metais pesados, tais como o chumbo, arsénio e manganês, constitui uma potencial ameaça para a saúde humana. A persistência destes metais no meio ambiente, juntamente com o seu uso intensivo pelas sociedades modernas, tem ao longo dos anos vindo a aumentar significativamente. Esta exposição pode ocorrer através do ar, alimentos ou água contaminada, e varia com o tipo de metal e com o nível de exposição a que estamos sujeitos. A toxicidade dos metais pesados reside essencialmente na formação de espécies reactivas de oxigénio, que desempenham um papel determinante para o desenvolvimento de efeitos adversos, tais como efeitos neurotóxicos e cancerígenos. O desenvolvimento de biomarcadores, que possibilitem a detecção de exposições continuadas, e/ou elevadas a metais pesados, e que possam assinalar atempadamente o aparecimento de efeitos adversos na fase inicial, enquanto o efeito tóxico for ainda reversível, é essencial para a saúde humana. Alguns metais interferem em pontos-chave da via metabólica da síntese do heme, alterando a excreção de porfirinas e de ácido delta-aminolevulínico (ALA) na urina; e promovem a oxidação das porfirinas reduzidas (porfirinogénios), que irão acumular-se em tecidos alvo, causando efeitos tóxicos no organismo. Concentrações urinárias de ALA superiores a 15 mg/L urina, podem provocar danos cerebrais em trabalhadores expostos, alucinações e convulsões. Neste sentido, o perfil de porfirinas e a concentração de ALA na urina são considerados biomarcadores de exposição e efeito para metais pesados. As porfirinas são compostos macrocíclicos, que desempenham um papel preponderante no metabolismo dos organismos vivos, participando em processos como a fotossíntese e transporte de oxigénio. No organismo, uroporfirina (uro), heptaporfirina (hepta), hexaporfirina (hexa), pentaporfirina (penta) e coproporfirina (copro) são produzidas em excesso, e por isso excretadas normalmente pela urina e fezes, em determinadas concentrações. No entanto, a excreção de porfirinas urinárias pode ser anormalmente elevada devido a vários factores: doenças como as porfirias, ingestão de determinados fármacos, e exposição ambiental a químicos, em particular metais pesados. Considerando as características estruturais e químicas das porfirinas é possível desenvolver métodos que permitam a sua extracção dos fluidos biológicos, e a sua posterior identificação e quantificação, possibilitando obter o perfil de porfirinas de cada indivíduo. A detecção de porfirinas através de métodos espectrofotométricos é eficaz e frequentemente utilizada, uma vez que estas apresentam um espectro característico com bandas na região do visível (400 a 750 nm), correspondentes à banda de Soret e bandas Q. Posteriormente, através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), foram desenvolvidos métodos altamente sensíveis que permitem a separação e identificação das várias porfirinas e a determinação da sua concentração em amostras biológicas. Novos e mais eficientes métodos que permitam uma melhor extracção e quantificação das porfirinas em diferentes fluidos biológicos, são necessários. O desenvolvimento de condições e meios de conservação eficazes, sem exporem as porfirinas a ambientes que interfiram com a sua fluorescência e absorvência, são igualmente necessários. Estes métodos serão uteis para melhorar o diagnóstico diferencial das porfirias, e aumentar a sensibilidade e especificidade das porfirinas como biomarcadores. Este trabalho teve como objectivos determinar as melhores condições de preservação de porfirinas em amostras de urina e avaliar vários métodos de extracção e quantificação de porfirinas, tendo em vista a obtenção de resultados mais rigorosos. Também, através da análise do perfil de porfirinas e do nível de ALA na urina de cada indivíduo, propomos biomarcadores de exposição e efeito, em subpopulações expostas em diferentes contextos de exposição a metais Amostras de urina de voluntários saudáveis, foram recolhidas e guardadas nas mesmas condições de temperatura (4º, -20º e -80 ºC), armazenamento (em alíquotas ou pool) e sem ou com conservantes (Na2CO3 ou HCl) ao longo de 90 dias. O perfil urinário de porfirinas determinado por HPLC, de cada amostra armazenada na respectiva condição, foi obtido no dia de recolha (dia 0), ao fim de uma semana (dia 7), ao fim de um mês (dia 30) e três meses depois (dia 90). Ao comparar as concentrações de porfirinas nas mesmas amostras em diferentes condições de conservação, é possível identificar quando houve perdas/ganhos de concentração de uro, hepta, hexa, penta e copro, em relação ao dia 0. As condições que não revelem diferenças significativas (p>0.05) são consideradas condições óptimas de conservação. Copro conseguiu manter-se estável a -20ºC e hepta a -80 ºC durante 90 dias, sem a adição de conservantes às amostras de urina. Na presença de Na2CO3, a copro permaneceu estável a -20 ºC e -80ºC e a hexa a -80 ºC, ao longo de 90 dias. Quando se utilizou HCl, a fracção uro manteve-se estável a -80ºC durante 90 dias. As amostras conservadas com Na2CO3 e HCl apresentaram concentrações mais estáveis ao longo do tempo do que amostras sem conservante. As amostras armazenadas em alíquotas apresentaram menos diferenças significativas de concentração em comparação com as denominadas de pools de urina. O método de Soulsby (1974) permite quantificar a concentração total de copro em urina, enquanto que o método de Elder (2001) permite quantificar a concentração de porfirinas totais, ambos através de espectrofotometria UV-Vis. A principal diferença entre os métodos, é que o método Soulsby utiliza éter e vários passos de extracção, enquanto o método Elder apenas acidifica a urina com HCl, não havendo qualquer extração. De forma a estudar cada método, utilizámos padrões de copro I e copro III e uro I para obter os respectivos espectros em UV-Vis, quando aplicados em matriz de água e urina. Também analisámos uma mistura equimolar constituída pelos 3 padrões. Analisámos 55 amostras de urina de indivíduos saudáveis, pelos métodos de Soulsby, Elder e HPLC como forma de comparar os diferentes métodos e inferir sobre a qualidade de resultados. O método de Soulsby falhou na extracção e quantificação de uro I, mas foi bem-sucedido para a copro I e III. O método de Elder permitiu quantificar os padrões de copro e uro, individualmente e sob a forma de mistura de padrões. Os métodos de Soulsby e HPLC apresentaram uma relação linear, ainda que fraca (R2=0,268), para a determinação de copro total na urina. Quando comparados, os métodos de Elder e HPLC para a análise de porfirinas totais, estes também apresentaram uma fraca relação linear entre si (R2= 0,086). Na última parte do trabalho, foram voluntariamente cedidas amostras de urina de 63 indivíduos de uma amostra de população portuguesa, divididos em vários grupos de acordo com o nível e forma de exposição a metais pesados: pessoas que vivem numa cidade de uma ilha portuguesa (Grupo I), pessoas que vivem numa grande área urbana (Grupo L), mineiros (Grupo M), pessoas que vivem numa área rural (Grupo A), técnicos hospitalares de Raios-X (Grupo R), pessoas que vivem numa área urbana não-industrializada (Grupo S), pessoas que vivem numa área urbana industrializada (Grupo V) e fumadores (Grupo F). Determinámos o perfil urinário de porfirinas por HPLC e os níveis de ALA na urina por um método colorimétrico. Estes valores foram combinados usando análise discriminante para criar um modelo capaz de identificar se um individuo tem um contexto de exposição igual a uma área/grupo específico. Estes biomarcadores foram posteriormente integrados em procedimentos preditivos recorrendo a ferramentas estatísticas. Aplicaram-se 3 procedimentos preditivos: o primeiro combinando todos os grupos com excepção do grupo I; o segundo, combinando apenas os grupos expostos ambientalmente (Grupo L, A, S e V), e o terceiro considerando apenas os grupos expostos activamente (Grupo M, R e S). Pela combinação dos biomarcadores determinados, o primeiro procedimento, apenas conseguiu classificar correctamente 76,8% dos individuos. No segundo procedimento, já foi possível classificar correctamente 96,8% dos indivíduos expostos ambientalmente nos diferentes contextos, em áreas urbanas industrializadas e não-industrializadas, numa área rural e numa grande área urbana, de Portugal. No terceiro procedimento, a discriminação de indivíduos expostos activamente a metais pesados de forma ocupacional (mineiros ou técnicos de Raios-X) ou estilo de vida (fumadores), foi alcançada com uma classificação de 100%. Do nosso estudo podemos concluir que para garantir a conservação de todas as porfirinas, especialmente as copro e uro, é necessário adicionar um conservante. Enquanto o Na2CO3, aumenta o pH do meio e conserva os analitos sob a forma de porfirinogénios, o HCl, acidifica a urina e promove a conversão de porfirinogénios a porfirinas. Sugerimos ainda que as amostras sejam armazenadas em alíquotas para garantir uma maior estabilidade das porfirinas urinárias. Este trabalho veio confirmar que a uro não é solúvel em éter, e por isso os métodos espectrofotométricos que o utilizem na extração não o conseguem quantificar. No entanto, estes métodos já são eficazes para análises de copro. As porfirinas totais conseguem ser detectadas em urina acidificada com HCl por espectrofotometria UV-Vis, e estimadas quantitativamente. O método de preferência deve ser HPLC, uma vez que permite a separação de cada porfirina e a sua quantificação individual, mas os métodos espectrofotométricos podem ser utilizados para uma análise rápida e preliminar. A combinação dos perfis de porfirinas com os níveis de ALA na urina pode ser utilizada como biomarcador de exposição e efeito de metais pesados, na amostra de população estudada, uma vez que os resultados dos procedimentos preditivos foram satisfatórios. A aplicação destes biomarcadores pode ser uma ferramenta útil para prever o tipo de exposição e a magnitude dos efeitos tóxicos provocados pelos metais em populações expostas, sendo por isso necessário continuar a investir no estudo das porfirinas e nas suas aplicações em Toxicologia Preditiva.Throughout our lives we are simultaneously exposed to single or multiple sources of metal mixtures in environmental or occupational contexts. Lead (Pb), Arsenic (As) and Manganese (Mn) are classified as human carcinogens and may also cause neurotoxic effects. These metals induce porphyrins and delta-aminolevulinic acid (ALA) accumulation, that results from the interference at specific points of the heme synthetic pathway. For this, porphyrins and ALA can be used as biomarkers of exposure and effect, contributing to prevent the risk of neurotoxicity in human populations. The aim of this work was to determine the best preservation conditions of urinary porphyrins and the most accurate method of extraction and quantification of specific and total porphyrins. We also intended to provide biomarkers for heavy metals, through the characterization of urinary porphyrins profiles and urinary levels of ALA, in a Portuguese sub-population sample. We experienced various storage conditions (aliquots or pools subjected to freeze-thaw cycles), different temperatures (4ºC, -20 ºC and -80 ºC), and two different preservatives, over time. The addition of a preservative, like HCl or Na2CO3, to urine aliquots preserved at -80ºC succeeded to stabilize uroporphyrin (uro) and coproporphyrin (copro) for at least 90 days. Through the analysis of copro (I and III) and uro (I) standards we conclude that spectrophotometric methods, that use ether to extract the porphyrins from urine, are not effective for uro determination, while copro, uro and total porphyrin can be detected in acidified urine by spectrophotometry, without extraction. However, HPLC should be the method of choice, once the various porphyrins are able to be separated and individually quantified through this method. We combined the urinary porphyrin profiles and ALA levels of 63 subjects, using discriminant analysis, to create a model aiming to identify whether an individual is in an exposure context according with a specific area/group. It was possible to correctly classify 96,8% of individuals environmentally exposed to metals in an urban, rural and industrial context, and 100% of the individuals actively exposed to metals (workers or smokers). The investigation of porphyrins and their precursors seems to provide tools for the development of Occupational Toxicology, highlighting predictive biomarkers of effect, and consequently the improvement of public health.Santos, Ana Paula Marreilha dos,1957-Rebelo, Maria Teresa Ferreira Ramos Nabais de Oliveira,1964-Repositório da Universidade de LisboaFernandes, Joana Filipa Cabral Vargas2019-12-27T01:30:12Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/31205TID:201878119enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:24:31Zoai:repositorio.ul.pt:10451/31205Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:46:43.860998Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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