Investigating the role of regulatory cysteine residues as functional redox switches in human persulfide dioxygenase

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Diogo Henrique Pires da
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/63039
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
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spelling Investigating the role of regulatory cysteine residues as functional redox switches in human persulfide dioxygenaseHydrogen sulfideOxidative post-translational modificationsPersulfide dioxygenases-cysteinylations-nitrosationTeses de mestrado - 2023Ciências da saúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O sulfureto de hidrogénio (H2S) regula diversos processos fisio(pato)lógicos, exercendo o seu papel de sinalização numa estreita gama de concentrações, mantida pelas enzimas de síntese e destoxificação. Várias patologias estão associadas ao metabolismo disfuncional do H2S, nomeadamente à expressão das enzimas do seu metabolismo. Menos informação é conhecida acerca da regulação por modificações pós-traducionais (PTMs). O facto de estas enzimas possuírem um grande número de resíduos de cisteína não envolvidos em pontes dissulfureto sugere um papel regulador destes como interruptores redox. Este projeto visa estudar PTMs oxidativas tendo como alvos resíduos de cisteína, especificamente da dioxigenase de persulfureto (PDO) humana. A PDO wild-type recombinante e variantes com substituições Cys→Ser foram produzidas e caracterizadas por técnicas biofísicas como dicroísmo circular, differential scanning fluorimetry e dynamic light scattering, para analisar perturbações estruturais das substituições e/ou PTMs oxidativas. Observou-se que, embora a estrutura α-helical da PDO pareça inalterada, as substituições levaram à diminuição da estabilidade térmica e aumento da propensão para agregação, dependendo da variante. Medições de atividade por respirometria de alta resolução revelaram que a maioria das variantes estavam cataliticamente afetadas, provavelmente associado à exposição dos resíduos ao solvente e à proximidade ao Fe catalítico e aos locais de ligação do substrato. Utilizando as mesmas metodologias, observou-se que a s-cisteinilação afetou globalmente a estabilidade da PDO e, apesar de diminuir a atividade máxima, eliminou o mecanismo de auto-inibição, proporcionando assim estabilidade cinética. Relativamente à inibição observada na s-nitrosação, permanece incerto se este efeito é consequência da modificação ou do óxido nítrico liberado pela reação com o substrato persulfureto de glutationa. Ensaios de cristalização foram realizados para tentar obter informações estruturais detalhadas. No geral, os resultados relatados nesta dissertação apontam para um papel regulador dos resíduos de cisteína na PDO humana, com diferentes consequências possíveis sob diferentes condições fisiológicas.Hydrogen sulfide (H2S) regulates many (patho)physiological processes such as inflammation and mitochondrial function, exerting its signaling role in a narrow physiological concentration range, maintained by specialized synthesizing and detoxification enzymes. Many pathologies have been associated with dysfunctional H2S metabolism, specifically concerning the expression of H2S metabolism enzymes. Less information is available regarding regulation by post-translational modifications (PTMs). The fact that human H2S metabolism enzymes possess an usually large number of cysteine residues not engaged in disulfide bridges suggests a regulatory role of these residues, as redox switches. This project aims to expand the knowledge on physiological oxidative PTMs that target cysteine residues, specifically of human persulfide dioxygenase (PDO). Recombinant wild-type PDO and variant proteins with single Cys→Ser substitutions were produced in bacteria. Biophysical techniques such as circular dichroism, differential scanning fluorimetry and dynamic light scattering were employed to probe structural perturbations from the substitutions and/or oxidative PTMs. It was observed that although PDO’s α-helical structure remained seemingly unchanged, these substitutions led to decreased thermal stability, and to increased propensity for aggregation, depending on the variant. Activity measurements by high resolution respirometry revealed that most variants were catalytically impaired, seemingly correlated with cysteine residue surface exposure, proximity to the catalytic Fe and to the substrate binding sites. Using the same methodologies, it was observed that s-cysteinylation globally affected PDO stability and, despite decreasing the maximal measured activity, eliminated the auto-inhibition mechanism, thus affording kinetic stability. The functional impairment observed upon s-nitrosation remains unclear as to whether this effect is a consequence of the modification or of nitric oxide released by reaction with the glutathione persulfide substrate. Crystallization trials were performed to attempt obtaining detailed structural information. Overall, the reported results point towards a regulatory role of cysteine residues in human PDO, with different possible outcomes under different physiological conditions.Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier da Universidade Nova de Lisboa.Vicente, João Filipe BogalhoLeandro, Ana Paula Costa dos Santos PeraltaRepositório da Universidade de LisboaSilva, Diogo Henrique Pires da2023-12-072023-10-272026-12-07T00:00:00Z2023-12-07T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/63039TID:203436350enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-04T01:21:05Zoai:repositorio.ul.pt:10451/63039Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:12:34.332414Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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